IL-17A對(duì)骨折急性期修復(fù)與愈合過程的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　利用臨床標(biāo)本、動(dòng)物模型以及體外實(shí)驗(yàn)探討內(nèi)源性和外源性白細(xì)胞介素-17A（Interleukin-17A, IL-17A，也稱作IL-17）對(duì)骨折急性期愈合過程的影響及其相關(guān)機(jī)制，旨在為治療骨折、縮短骨折愈合時(shí)間、探索治療骨不連疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路。
　　方法：
　　1.采集單純長(zhǎng)骨骨干骨折患者受傷后不同時(shí)間點(diǎn)外周血，以及健康人群志愿者外周血。
　　2.采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)骨折患者不同時(shí)間點(diǎn)及健康人外周

2、血單核細(xì)胞中輔助T細(xì)胞-17（T-help-17, Th17）的比例進(jìn)行分析，并應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)受試者血清中IL-17A水平。
　　3.對(duì)臨床納入實(shí)驗(yàn)的常見的單純長(zhǎng)骨干骨折患者行骨折切開復(fù)位內(nèi)固定手術(shù)，術(shù)中提取骨折周圍部分軟組織標(biāo)本，免疫組化檢測(cè)骨折周圍部分軟組織標(biāo)本IL-17A的表達(dá)水平。
　　4.利用C57 BL/6遺傳背景的IL-17A-/-小鼠（Knock Out, KO）和野生型（Wild Type, WT）

3、為研究對(duì)象，建立野生型和IL-17A-/-小鼠股骨干骨折動(dòng)物模型。應(yīng)用X-ray和Micro-CT技術(shù)于模型建立后的第3,7,14,21,28天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象骨折愈合程度。
　　5.采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)小鼠股骨干骨折動(dòng)物模型骨折斷端周圍組織中IL-17A的表達(dá)情況；分別應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（qRT-PCR）和免疫蛋白印跡技術(shù)(Western blot, WB)檢測(cè)骨折斷端周圍組織中成骨相關(guān)基因Runx

4、2、Col1、Col2、SOX9、Osterix的mRNA表達(dá)以及β-catenin、SOX9、Col2、Osterix的蛋白表達(dá)水平。
　　6.分別從C57 BL/6WT和IL-17AKO新生小鼠的顱骨制備原代成骨細(xì)胞，分別應(yīng)用qRT-PCR和WB技術(shù)檢測(cè)上述細(xì)胞成骨相關(guān)基因β-catenin、SOX9、Col1、Col2和Runx2的mRNA及其蛋白水平；分別以rhIL-17A、rhIL-17A+DKK1（β-catenin抑

5、制劑）、rhIL-17A+DAPT（Notch抑制劑）處理上述細(xì)胞，培養(yǎng)3、7天，以qRT-PCR和WB技術(shù)檢測(cè)成骨相關(guān)基因β-catenin、SOX9、Col1、Col2和Runx2的mRNA及其蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.本研究共納入診斷為單純長(zhǎng)骨干骨折患者22例，經(jīng)篩選配對(duì)，共入選志愿者22例?；颊呓M與健康對(duì)照組之間年齡、性別等一般資料均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.被納入的單純長(zhǎng)骨干骨折患者在受傷后第1天，

6、和對(duì)照組相比，外周血中Th17細(xì)胞比例稍高（P＜0.05）；在觀察點(diǎn)內(nèi)固定手術(shù)后第3天，和對(duì)照組相比外周血中Th17細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.01），與受傷后第1天相比也明顯升高（P＜0.01）；在術(shù)后第7天與術(shù)后第1天相比，Th17細(xì)胞比例降低（P＜0.05），與對(duì)照組相比，Th17細(xì)胞比例仍然稍高，但不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3.血清IL-17A含量使用 ELISA檢測(cè)法結(jié)果顯示，受傷后第1天，血清 IL-17A

7、含量較對(duì)照組基線開始升高，在術(shù)后第3天明顯升高，與骨折后第1天對(duì)比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），術(shù)后第7天較骨折后第1天也有所升高，但不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.X-ray結(jié)果顯示：骨折模型建模后第3天，KO及WT實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蟮墓钦蹟喽藢?duì)位對(duì)線均較好，骨折斷端兩側(cè)無明顯扭轉(zhuǎn)、位移，錯(cuò)位程度在正常范圍；骨折線都較為清晰，骨折斷端周圍尚無新生骨痂形成；這兩種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蠼蕴幱谘[機(jī)化期。骨折模型建模后第7天，KO及WT實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蟮?/p>

8、模型骨折斷端對(duì)位對(duì)線較好，骨折斷端兩側(cè)無明顯扭轉(zhuǎn)、位移；兩種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蠊钦蹟喽硕驾^3天更為清晰，骨折斷端周圍尚無新生骨痂形成。骨折模型建模后第14天，KO及WT實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蠊钦蹟喽酥車霈F(xiàn)骨痂影，骨折線開始模糊。骨折模型建模后第21天，KO及WT實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蠊钦蹟喽酥車霈F(xiàn)大量骨痂影，成紡錘型影像影，WT實(shí)驗(yàn)小鼠骨折線已經(jīng)消失。骨折模型建模后第28天， KO及WT實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蠊晒钦蹟喽颂幑丘栎^前時(shí)相縮小，WT實(shí)驗(yàn)組小鼠骨折斷端處改建已

9、經(jīng)基本完成。
　　5. Micro-CT發(fā)現(xiàn)在建模3天后骨折斷端可見骨折斷端對(duì)合良好，KO及WT實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蠊晒菢?biāo)本設(shè)定興趣區(qū)BV/TV值無顯著差異；而在建模后7、14、21天發(fā)現(xiàn)WT模型組較KO模型組骨折斷端周圍較早出現(xiàn)新生骨痂，形態(tài)呈坡形隆起，骨痂內(nèi)有新生骨組織，KO及WT兩組實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蟮墓晒菢?biāo)本設(shè)定興趣區(qū)BV/TV值存在明確顯著性差異（P<0.05），KO模型組骨折斷端骨量較WT模型組減低。建模后28天，KO及WT實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

10、小鼠股骨骨折斷端均已愈合完成改建，KO及WT實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蠊晒菢?biāo)本設(shè)定興趣區(qū)BV/TV值無顯著差異（P>0.05）。
　　6.采用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析小鼠骨折模型股骨組織標(biāo)本中IL-17A的表達(dá)：WT模型組小鼠股骨組織標(biāo)本在建模后3、7、14天骨折斷端周圍軟組織及骨痂中均有IL-17A的表達(dá)，建模后3、7天表達(dá)強(qiáng)度較高； KO模型組小鼠股骨組織標(biāo)本在建模后3、7、14天骨折斷端周圍軟組織及骨痂中均無IL-17A的表達(dá)。在模型建立后2

11、1、28天，KO及WT實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蠊晒墙M織標(biāo)本骨折斷端周圍軟組織及骨痂中均未探測(cè)到IL-17A的表達(dá)。
　　7.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析結(jié)果：在建模后第3、7、14天，WT模型組小鼠股骨骨折斷端處周圍軟組織及骨痂組織標(biāo)本中β-catenin、SOX9、Col1、Col2、Osterix和Runx2的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于KO模型組組織標(biāo)本（P<0.05）。在建模后第21天，WT模型組小鼠股骨骨折斷端處周圍軟組織及骨痂組織

12、標(biāo)本中Col1、Col2及β-catenin的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平依然顯著高于KO模型組組織標(biāo)本（P<0.05），然而SOX9、Osterix和Runx2的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在兩組之間已無顯著性差異（P>0.05）。在建模后第28天，WT模型組小鼠股骨骨折斷端處周圍軟組織及骨痂組織標(biāo)本中Col2與β-catenin的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)顯著高于KO模型組組織標(biāo)本，兩組間扔存在顯著性差異（P<0.05），Col1、SOX9、Osterix

13、和Runx2的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在兩組之間已無顯著性差異（P>0.05）。
　　8.兩組骨折模型造模后第0天，目標(biāo)蛋白β-catenin、SOX9、Col1、Col2、Osterix在兩組骨折斷端處周圍軟組織標(biāo)本中表達(dá)并未見顯著性差異（P>0.05）；骨折模型造模后第3、7、14、21天，β-catenin、SOX9、Col1、Col2、Osterix表達(dá)均有顯著差異（P<0.05），KO組小鼠骨折斷端處周圍軟組織標(biāo)本表達(dá)量明顯低

14、于WT組；但是于骨折模型造模后第14天，SOX9蛋白表達(dá)未見明顯差異，骨折模型造模后第21天，Col2蛋白表達(dá)水平未見顯著性差異；骨折模型造模后第28天，Col2、SOX9蛋白表達(dá)水平仍有顯著性差異，β-catenin、Osterix蛋白表達(dá)水平未見顯著性差異（P>0.05）。
　　9. WT小鼠原代成骨細(xì)胞中β-catenin、SOX9、Col1、Col2、BMP2、Runx2的轉(zhuǎn)錄水平均高于KO小鼠原代成骨細(xì)胞；靶分子β-ca

15、tenin在外源性的IL-17A存在的情況下mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于KO組的轉(zhuǎn)錄水平，β-catenin抑制劑DKK1可以明顯抑制各組中β-catenin的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，同時(shí)降低了成骨相關(guān) SOX9、Col1、Col2、BMP2、Runx2的轉(zhuǎn)錄水平；在連續(xù)培養(yǎng)3-7天，我們發(fā)現(xiàn)DKK1可以明顯抑制各組中β-catenin的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，并且使成骨細(xì)胞各成骨相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平峰值后移；IL-17A對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用的機(jī)制可能依賴Wnt

16、信號(hào)通路。并且，在對(duì)外源性IL-17A刺激的響應(yīng)上，IL-17A-/-基因敲除小鼠的成骨細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達(dá)，與WT小鼠相比更加后滯，這說明IL-17A-/-基因敲除小鼠對(duì)外源性IL-17A的刺激響應(yīng)不敏感。
　　10. WT小鼠原代成骨細(xì)胞中Notch、Hes1、Rjbpκ的轉(zhuǎn)錄水平均低于KO小鼠原代成骨細(xì)胞，但Col2、Osterix的轉(zhuǎn)錄水平均高于KO小鼠原代成骨細(xì)胞；在外源性的IL-17A存在的情況下，WT組靶分子Not

17、ch、Rjbpκ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于KO組；Notch抑制劑DAPT明顯下調(diào)了各組中Notch、Rjbpκ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)了成骨相關(guān)Col2、Osterix的轉(zhuǎn)錄水平；IL-17A對(duì)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也存在調(diào)控作用；IL-17A對(duì)KO及WT小鼠原代成骨細(xì)胞中Notch、Rjbpκ蛋白水平的表達(dá)有抑制作用，在加入DAPT后，Notch、Rjbpκ蛋白水平的表達(dá)受抑制，成骨蛋白Col2、Osterix的表達(dá)增強(qiáng)，這種較強(qiáng)的

18、作用持續(xù)到連續(xù)培養(yǎng)的第5天，而后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這種作用于7天后趨于平穩(wěn)；并且，與WT小鼠成骨細(xì)胞相比，IL-17A-/-基因敲除小鼠的成骨細(xì)胞對(duì)于外源性IL-17A的刺激的信號(hào)調(diào)控存在顯著性差異；WT小鼠成骨細(xì)胞對(duì)外源性IL-17A的刺激更加敏感。
　　結(jié)論：
　　通過體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床標(biāo)本分析，本研究結(jié)果提示：IL-17A可參與骨折愈合的整個(gè)過程，促進(jìn)骨折斷端周圍組織中β-catenin、SOX9、Col1、Col