ERα及miR-30e通過調控MTA1降低EMT發(fā)生潛能抑制肝癌侵襲與轉移的機制研究.pdf

1、肝細胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是危害我國人民健康的重大疾病之一，其發(fā)病率列全球惡性腫瘤第六位，死亡率列第三位。HCC是一種血管豐富的腫瘤，相對于其他實體腫瘤而言，其早期發(fā)現(xiàn)比較困難，確診時高達90％以上的患者已屬中、晚期。值得關注的是，HCC具有高轉移性和侵襲性的特征，特別是肝內和遠處轉移以及頻繁的術后復發(fā)，是導致其高死亡率的主要原因。為了提高早期診斷和改善預后，迫切需要進一步探究促進HCC發(fā)展和

2、發(fā)生早期轉移的詳細機制。同時，大量的臨床病例資料顯示HCC的發(fā)生及進展還表現(xiàn)出顯著的性別差異。逐漸得到的共識是雌激素在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中起著十分重要的作用，但是，相比于其他性激素敏感器官，雌激素在肝癌中作用的研究相對較少，特別是對分子機理的探討明顯不足。因此，本研究以大量人體慢性肝炎及肝細胞癌標本為基礎，結合體外實驗及動物模型，系統(tǒng)研究了ERα及miR-30e在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其分子機制，獲得以下主要結果:
　　1.

3、基于大量人類肝細胞肝癌臨床標本，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應和免疫組織化學的方法以人正常肝組織為對照，分別檢測肝癌切除術后所得的腫瘤組織及相應的癌旁組織中轉移相關基因1(metastasis-associated gene1，MTA1)的表達水平，通過Kaplan-Meier曲線研究不同MTA1表達水平與HCC患者生存率及復發(fā)率之間的關系。結果發(fā)現(xiàn):MTA1在肝癌組織及癌旁肝硬化組織中的轉錄表達明顯高于正常組織(P＜0.01)，同時，M

4、TA1蛋白在肝癌組織及癌旁肝硬化組織中的表達也明顯高于正常組織(P＜0.01)。通過Kaplan-Meier曲線及Log-rank檢驗證明MTA1能夠影響腫瘤的復發(fā)及患者的生存期。本研究通過對以上實驗數(shù)據(jù)的分析提示，MTA1可以作為判斷肝癌肝切除術后腫瘤復發(fā)及患者生存率預測的指標。
　　2.肝癌發(fā)病性別差異一直是國際肝癌學術界研究熱點，基于大量人類肝癌標本，利用實時熒光定量PCR和Western blot的方法檢測MTA1基因的表

5、達水平;運用Edu摻入和Transwell小室侵襲實驗分別就MTA1對肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響進行評估;并利用shRNA技術和雙熒光素酶報告基因實驗來研究細胞系中ERα對MTA1的調控作用。結果發(fā)現(xiàn)，MTA1在男性HCC及癌旁組織中較正常肝組織顯著性地高表達，然而，在女性患者標本中沒有類似發(fā)現(xiàn)。并且與正常肝組織比較，ERα在男性腫瘤和癌旁組織中表達顯著地降低，男性腫瘤及癌旁組織中MTA1增加量與ERα減少量呈線性相關。通過體外細胞模

6、型及啟動子活性分析表明，MTA1啟動子上有3個功能性雌激素受體結合元件（ERE）的半結合位點，雌激素(E2)能夠結合ERα從轉錄水平抑制肝癌細胞中MTA1的表達。過表達ERα可抑制肝癌細胞的增殖和侵襲能力;另一方面，過表達MTA1可以減弱ERα介導的對肝癌細胞增殖和侵襲的抑制作用以及其在體內實驗中，對腫瘤形成的抑制作用。這表明，ERα和MTA1之間存在反饋調節(jié)關系?？傊?，的結果表明，ERα通過下調MTA1基因的轉錄，抑制了人肝癌細胞的增

7、殖和侵襲能力。因此，通過本研究闡明了另一條可用于解釋肝癌發(fā)病性別差異性的通路:男性肝癌及癌旁組織中ERα下調，從而使處于肝硬化和癌變早期的肝細胞失去雌激素的保護作用，并導致MTA1高表達，最終通過其下游信號通路激活導致肝癌的在男性中高發(fā)。
　　3.已知MTA1是一個典型的轉移相關蛋白，它在上皮-間質轉化(EMT)發(fā)生的過程中是至關重要的，然而，涉及其上、下游調控機制的相關知識還知之甚少。本研究中，致力于探討在人類肝細胞癌(HCC)

8、中MTA1上游的調控因子和其下游的效應靶點以及其作用機制。實驗中采用實時熒光定量聚合酶鏈反應和免疫組化的方法檢測不同基因的表達水平，應用統(tǒng)計學分析和生物信息學方法來預測它們之間潛在的相關性和調控關系，并進一步通過體內和體外實驗以驗證上述調控關系。研究納入了總共94對HCC腫瘤和癌旁組織樣本，檢測結果表明，在人類HCC中，miR-30e的減少與MTA1的增加相關聯(lián)，miR-30e可以結合在MTA1基因的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)從而在轉

9、錄后水平調控MTA1的表達，并與EMT的發(fā)生負相關。進一步的，在人類HCC中，MTA1的顯著高表達與ErbB2的過表達相關聯(lián)，MTA1可與組蛋白去乙酰化酶(HDAC2)結合形成復合物作為一個轉錄因子促進ErbB2的轉錄。MTA1促進EMT發(fā)生的效應很大程度上依賴于ErbB2，體內和體外實驗均表明或是沉默或是抑制了ErbB2的活性，可以顯著地減弱由過表達MTA1所介導的EMT的發(fā)生?？傊难芯勘砻?，在人類HCC中miR-30e的下調可以

10、增加MTA1的表達，并進一步地通過增加ErbB2的表達促進了肝癌細胞的侵襲和轉移。
　　綜上所述，通過研究表明，MTA1不僅參與肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展，而且與其術后復發(fā)、預后不良以及低生存率等臨床特征密切相關。一方面，ERα在男性肝癌及癌旁組織中下調，通過轉錄水平的調控，導致MTA1高表達，有利于增強肝癌細胞的增殖和侵襲能力，影響肝癌惡性程度及轉移潛能等生物學特性;另一方面，在人類HCC中下調的miR-30e也可以在轉錄后水平調控MT