脾源性炎癥反應(yīng)在重型顱腦損傷大鼠中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　 近年來(lái)，各種原因造成的創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）有逐年增加的趨勢(shì)。重型顱腦損傷患者約占全部腦損傷的20％左右，其死亡率高達(dá)20～50％，已經(jīng)成為青少年致死、致殘的首要原因，為家庭和社會(huì)帶來(lái)的沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神痛苦。研究如何提高重型顱腦損傷患者的救治效果具有重要的意義。
　　 TBI 包括原發(fā)性和繼發(fā)性腦損傷。繼發(fā)性腦損傷是指?jìng)笾饾u形成的損傷；顱腦損傷后血腦

2、屏障（blood-brain barrier，BBB）的破壞、小膠質(zhì)細(xì)胞激活、細(xì)胞因子和趨化因子等的釋放、白細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的侵潤(rùn)等共同參與和促進(jìn)了繼發(fā)性腦損傷的形成，往往造成難以控制的創(chuàng)傷性腦水腫，是重型顱腦損傷患者死亡的首要原因。
　　 目前有關(guān)TBI后創(chuàng)傷性腦水腫形成的機(jī)制研究多集中在腦組織局部，而機(jī)體外周組織器官對(duì)繼發(fā)性腦損傷的作用尚不清楚。有研究表明，TBI 尤其是重型顱腦損傷后機(jī)體常伴發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征（system

3、ic inflammatory response syndrome，SIRS），是免疫系統(tǒng)被過(guò)度激活的結(jié)果，伴有多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)增加，如白介素1β（interleukin1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、IL-6等，而這些細(xì)胞因子在繼發(fā)性腦損傷的病理過(guò)程中也有重要作用。脾臟是人體最大的免疫器官，含有多種免疫活性細(xì)胞，在應(yīng)激下能夠釋放多種炎癥介質(zhì)，同時(shí)也是SIRS 發(fā)生的

4、重要效應(yīng)器官。因此我們推測(cè)，TBI后脾臟的免疫功能被激活，免疫活性細(xì)胞及大量促炎因子通過(guò)破壞的BBB 而到達(dá)創(chuàng)傷區(qū)域腦組織，進(jìn)一步促進(jìn)腦組織局部的炎癥反應(yīng)，加重創(chuàng)傷性腦水腫的程度。
　　 為了驗(yàn)證上述假設(shè)，本研究分三部分進(jìn)行，第一部分建立重型顱腦損傷大鼠模型，觀察TBI后立即行脾臟切除對(duì)大鼠死亡率及腦組織含水量及大鼠認(rèn)知功能的影響；第二部分檢測(cè)了TBI后脾臟內(nèi)炎癥因子的表達(dá)以及脾臟切除對(duì)大鼠TBI后血液及腦組織局部炎癥因子表達(dá)的

5、影響；第三部分檢測(cè)了脾臟切除對(duì)重型顱腦損傷大鼠創(chuàng)傷區(qū)域腦組織MAPK信號(hào)通路主要分子表達(dá)的影響，并通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12細(xì)胞（代替神經(jīng)元）、小鼠源性小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞，檢測(cè)了腦創(chuàng)傷大鼠脾臟上清對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響以及對(duì)BV-2細(xì)胞MAPK-NF-κ B通路的影響，進(jìn)一步明確脾臟在TBI后創(chuàng)傷性腦水腫形成的作用和機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 整個(gè)研究包括在體和離體實(shí)驗(yàn)。在體實(shí)驗(yàn)建立了SD大鼠

6、重型顱腦損傷模，并觀察脾臟切除對(duì)外周及腦組織炎癥反應(yīng)水平的影響；離體實(shí)驗(yàn)以大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12模擬神經(jīng)元，培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞，并觀察TBI大鼠脾臟對(duì)其的作用及具體機(jī)制。
　　 1.應(yīng)用Feeney 法建立SD大鼠重型顱腦損傷模型；
　　 2.將SD大鼠分為Sham （假手術(shù)組），TBI （重型顱腦損傷組），以及TBI&SPX（重型顱腦損傷后立即行脾臟切除）三組，分別測(cè)定大鼠腦組織含水量以及死亡率；
　　

7、 3.應(yīng)用Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)和空間搜索試驗(yàn)檢測(cè)Sham、TBI、及TBI&SPX三組內(nèi)大鼠的認(rèn)知功能；
　　 4.ELISA 法檢測(cè)重型顱腦損傷大鼠傷后不同時(shí)間脾臟內(nèi)IL-1β和TNF-α的濃度變化；
　　 5. ELISA 法檢測(cè)Sham、TBI、及TBI&SPX 三組內(nèi)大鼠傷后不同時(shí)間血清中IL-1β、TNF-α、IL-6 以及IL-10水平；
　　 6. 熒光定量RT-PCR 檢測(cè)Sham、T

8、BI、及TBI&SPX 三組內(nèi)大鼠傷后不同時(shí)間致傷處腦組織IL-1β、TNF-α、IL-6 以及IL-10的mRNA表達(dá)水平；
　　 7. Western blot 法檢測(cè)Sham、TBI、及TBI&SPX 三組大鼠腦組織內(nèi)p38 MAPK、ERK、PI3K 以及NF-κ B表達(dá)的影響；
　　 8. 以PC12細(xì)胞體外模擬神經(jīng)元，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重型顱腦損傷大鼠脾臟上清液對(duì)其凋亡率的影響；
　　 9. 應(yīng)用West

9、ern blot 檢測(cè)重型顱腦損傷大鼠脾臟上清對(duì)體外培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK、ERK 以及JNK的表達(dá)變化；激光共聚焦檢測(cè)脾臟上清對(duì)BV-2細(xì)胞內(nèi)NF-κ B 激活的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.SD大鼠顱腦損傷后死亡率為35.42％，與人類(lèi)重型顱腦損傷后死亡率基本相符；
　　 2.腦創(chuàng)傷后行脾臟切除能夠顯著降低SD大鼠的死亡率，并且能夠緩解傷后早期腦組織水腫的程度；
　　 3.重型顱腦

10、損傷大鼠傷后立即行脾臟切除能夠有效地改善大鼠的認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)能力；
　　 4.重型顱腦損傷后脾臟能夠釋放大量IL-1β和TNF-α，其中TNF-α反應(yīng)迅速，傷后短時(shí)間內(nèi)（3 h）即顯著增高；5. 脾臟切除能夠有效地降低重型顱腦損傷大鼠傷后血漿中IL-1β、TNF-α以及IL-6的含量，并且能夠顯著降低致傷區(qū)域腦組織IL-1β、TNF-α以及IL-6的mRNA水平；
　　 6. 脾臟切除能夠有效地降低重型顱腦損傷大鼠致傷區(qū)

11、域腦組織內(nèi)p38 MAPK、ERK、以及NF-κ B的蛋白表達(dá)，其中以p38 MAPK下降更為顯著；
　　 7. 重型顱腦損傷大鼠脾臟上清刺激PC12后能夠使其凋亡率顯著增高，當(dāng)與BV-2細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)凋亡率進(jìn)一步增加；應(yīng)用IL-1受體拮抗劑（IL-1RA）能夠有效降低其凋亡數(shù)量；
　　 8. 重型顱腦損傷大鼠脾臟上清能夠使BV-2細(xì)胞內(nèi)MAPK分子表達(dá)增高，以p38MAPK 最顯著；并且能夠激活BV-2細(xì)胞內(nèi)NF-κ B

12、，促進(jìn)其向細(xì)胞核內(nèi)移位；
　　 9. IL-1RA能夠有效地逆轉(zhuǎn)脾臟上清對(duì)BV-2細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)分子的表達(dá)，并促進(jìn)NF-κ B 向胞漿中轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)論:
　　 1.重型顱腦損傷大鼠傷后立即行脾臟切除能夠有效減輕腦組織水腫程度，降低大鼠死亡率，并有效改善其認(rèn)知和學(xué)習(xí)功能；
　　 2.TBI后脾臟能夠釋放大量IL-1β、TNF-α等炎癥因子；促進(jìn)系統(tǒng)及腦創(chuàng)傷局部炎癥反應(yīng)；
　　 3.TBI大鼠