氧化應(yīng)激損傷中NFKB1多態(tài)性對NF-κB信號通路及細胞凋亡的分子機制研究.pdf

1、目的：以H2O2誘導人原代臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）建立體外氧化應(yīng)激損傷模型，觀測核因子κB1基因-94號位點ATTG插入／缺失（-94ins/del ATTG，rs28362491）對NF-κB信號通路及細胞凋亡的影響。
　　方法：1）分離并培養(yǎng)原代HUVECs，細胞純度鑒定采用免疫熒光法檢測vWF抗體表達及流式細胞儀檢測CD31抗體表達；2）采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）法將HUVEC分為插入型（

2、II型）、缺失型（DD型）以及雜合子型（ID型）；3）Western blot法及免疫熒光標記法檢測NFKB1不同基因型HUVECs中P50蛋白的表達水平；4）CCK-8法檢測不同濃度及不同誘導時間H2O2對HUVECs活力的影響，選取最適宜的H2O2誘導濃度及時間，建立體外氧化應(yīng)激損傷模型；5）以H2O2誘導HUVECs激活NF-κB信號通路，Western blot法及免疫熒光標記法檢測NFKB1不同基因型HUVECs細胞核內(nèi)P50

3、、P65蛋白表達水平；6）以H2O2誘導HUVECs細胞凋亡，Western blot法及流式細胞儀檢測NFKB1不同基因型細胞凋亡情況。
　　結(jié)果：1）實驗共收集細胞63株，免疫熒光法檢測vWF抗體表達量為98±0.12％，流式細胞儀檢測CD31抗體表達量為93.3%；2）PCR-RFLP分型結(jié)果顯示：所收集的63株HUVECs中，NFKB1插入型（II型）13株，缺失性（DD型）13株，雜合子型（ID型）37株；3）Weste

4、rn blot及免疫熒光結(jié)果顯示：DD型P50蛋白表達水平較II型顯著降低；4）CCK-8結(jié)果顯示：200 umol/L H2O2誘導HUVECs12 h即可明顯降低細胞活力；5）Western blot及免疫熒光結(jié)果顯示：200 umol/L H2O2誘導HUVECs12 h可激活NF-κB信號通路，且DD型HUVECs細胞核中P50、P65蛋白表達水平顯著低于II型；6）Western blot及流式細胞學檢測結(jié)果顯示：200 um

5、ol/L H2O2誘導HUVECs12 h可誘導細胞發(fā)生凋亡，且DD型凋亡水平較II型顯著增高。
　　結(jié)論：1）原代臍靜脈內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)可以獲得高純度的HUVECs，且具有簡單、實用、有效、易操作等特點；2）NFKB1基因多態(tài)性可影響NF-κB信號通路中P50蛋白的表達水平；3）H2O2可抑制HUVECs活力，建立體外氧化應(yīng)激損傷模型；4）H2O2誘導HUVECs可激活細胞內(nèi)NF-κB信號通路，NFKB1基因多態(tài)性可影響NF-κ