氧化應(yīng)激損傷中NFKB1多態(tài)性對(duì)NF-κB信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：以H2O2誘導(dǎo)人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）建立體外氧化應(yīng)激損傷模型，觀測(cè)核因子κB1基因-94號(hào)位點(diǎn)ATTG插入／缺失（-94ins/del ATTG，rs28362491）對(duì)NF-κB信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：1）分離并培養(yǎng)原代HUVECs，細(xì)胞純度鑒定采用免疫熒光法檢測(cè)vWF抗體表達(dá)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD31抗體表達(dá)；2）采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）法將HUVEC分為插入型（

2、II型）、缺失型（DD型）以及雜合子型（ID型）；3）Western blot法及免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)NFKB1不同基因型HUVECs中P50蛋白的表達(dá)水平；4）CCK-8法檢測(cè)不同濃度及不同誘導(dǎo)時(shí)間H2O2對(duì)HUVECs活力的影響，選取最適宜的H2O2誘導(dǎo)濃度及時(shí)間，建立體外氧化應(yīng)激損傷模型；5）以H2O2誘導(dǎo)HUVECs激活NF-κB信號(hào)通路，Western blot法及免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)NFKB1不同基因型HUVECs細(xì)胞核內(nèi)P50

3、、P65蛋白表達(dá)水平；6）以H2O2誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡，Western blot法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)NFKB1不同基因型細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：1）實(shí)驗(yàn)共收集細(xì)胞63株，免疫熒光法檢測(cè)vWF抗體表達(dá)量為98±0.12％，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD31抗體表達(dá)量為93.3%；2）PCR-RFLP分型結(jié)果顯示：所收集的63株HUVECs中，NFKB1插入型（II型）13株，缺失性（DD型）13株，雜合子型（ID型）37株；3）Weste

4、rn blot及免疫熒光結(jié)果顯示：DD型P50蛋白表達(dá)水平較II型顯著降低；4）CCK-8結(jié)果顯示：200 umol/L H2O2誘導(dǎo)HUVECs12 h即可明顯降低細(xì)胞活力；5）Western blot及免疫熒光結(jié)果顯示：200 umol/L H2O2誘導(dǎo)HUVECs12 h可激活NF-κB信號(hào)通路，且DD型HUVECs細(xì)胞核中P50、P65蛋白表達(dá)水平顯著低于II型；6）Western blot及流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：200 um

5、ol/L H2O2誘導(dǎo)HUVECs12 h可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且DD型凋亡水平較II型顯著增高。
　　結(jié)論：1）原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)可以獲得高純度的HUVECs，且具有簡(jiǎn)單、實(shí)用、有效、易操作等特點(diǎn)；2）NFKB1基因多態(tài)性可影響NF-κB信號(hào)通路中P50蛋白的表達(dá)水平；3）H2O2可抑制HUVECs活力，建立體外氧化應(yīng)激損傷模型；4）H2O2誘導(dǎo)HUVECs可激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路，NFKB1基因多態(tài)性可影響NF-κ