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文檔簡介
1、目的:以H2O2誘導人原代臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)建立體外氧化應(yīng)激損傷模型,觀測核因子κB1基因-94號位點ATTG插入/缺失(-94ins/del ATTG,rs28362491)對NF-κB信號通路及細胞凋亡的影響。
方法:1)分離并培養(yǎng)原代HUVECs,細胞純度鑒定采用免疫熒光法檢測vWF抗體表達及流式細胞儀檢測CD31抗體表達;2)采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)法將HUVEC分為插入型(
2、II型)、缺失型(DD型)以及雜合子型(ID型);3)Western blot法及免疫熒光標記法檢測NFKB1不同基因型HUVECs中P50蛋白的表達水平;4)CCK-8法檢測不同濃度及不同誘導時間H2O2對HUVECs活力的影響,選取最適宜的H2O2誘導濃度及時間,建立體外氧化應(yīng)激損傷模型;5)以H2O2誘導HUVECs激活NF-κB信號通路,Western blot法及免疫熒光標記法檢測NFKB1不同基因型HUVECs細胞核內(nèi)P50
3、、P65蛋白表達水平;6)以H2O2誘導HUVECs細胞凋亡,Western blot法及流式細胞儀檢測NFKB1不同基因型細胞凋亡情況。
結(jié)果:1)實驗共收集細胞63株,免疫熒光法檢測vWF抗體表達量為98±0.12%,流式細胞儀檢測CD31抗體表達量為93.3%;2)PCR-RFLP分型結(jié)果顯示:所收集的63株HUVECs中,NFKB1插入型(II型)13株,缺失性(DD型)13株,雜合子型(ID型)37株;3)Weste
4、rn blot及免疫熒光結(jié)果顯示:DD型P50蛋白表達水平較II型顯著降低;4)CCK-8結(jié)果顯示:200 umol/L H2O2誘導HUVECs12 h即可明顯降低細胞活力;5)Western blot及免疫熒光結(jié)果顯示:200 umol/L H2O2誘導HUVECs12 h可激活NF-κB信號通路,且DD型HUVECs細胞核中P50、P65蛋白表達水平顯著低于II型;6)Western blot及流式細胞學檢測結(jié)果顯示:200 um
5、ol/L H2O2誘導HUVECs12 h可誘導細胞發(fā)生凋亡,且DD型凋亡水平較II型顯著增高。
結(jié)論:1)原代臍靜脈內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)可以獲得高純度的HUVECs,且具有簡單、實用、有效、易操作等特點;2)NFKB1基因多態(tài)性可影響NF-κB信號通路中P50蛋白的表達水平;3)H2O2可抑制HUVECs活力,建立體外氧化應(yīng)激損傷模型;4)H2O2誘導HUVECs可激活細胞內(nèi)NF-κB信號通路,NFKB1基因多態(tài)性可影響NF-κ
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