NF-κB信號通路對肺腺癌細胞株H1299高氧化應激條件下hTERT線粒體轉(zhuǎn)位的影響.pdf

1、研究背景與目的：
　　肺癌仍是最普遍和最致命的的癌癥,其發(fā)病率與病死率在過去的幾十年內(nèi)迅速增長,迄今為止,病死率已居惡性腫瘤之首。目前對于肺癌的治療手段主要有：手術治療、化療、放療、靶向治療等，已經(jīng)形成了多學科綜合治療方案。但是肺癌患者的5年生存率仍然較低。因此研究者們在積極的探索肺癌新的治療方法。
　　端粒酶是由RNA組分和蛋白組分組成的核蛋白體。其中人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse tr

2、anscriptase, hTERT）是端粒酶的催化亞基是端粒酶活性的必需和限速成分,其水平?jīng)Q定細胞端粒酶的活性。端粒酶活性被認為在細胞永生化和癌變中起關鍵作用，與肺癌的發(fā)生，發(fā)展，轉(zhuǎn)移有密切關系，因此hTERT有望成為肺癌治療的新靶點。
　　hTERT主要功能是維持端粒的長度，而近年來hTERT許多非依賴端粒的作用被發(fā)現(xiàn)，包括：基因的表達調(diào)控，對細胞生長和繁殖的調(diào)控，在線粒體中保護線粒體的功能等。同時有學者研究發(fā)現(xiàn)了hTERT在

3、亞細胞結構的分布情況：約60％在細胞核、20%在線粒體、20%在細胞質(zhì)。然而這個比例并不是一成不變的，在高氧化應激條件下，核內(nèi)的hTERT于24小時內(nèi)向核外轉(zhuǎn)移50%-60%。因此，hTERT在細胞內(nèi)處于動態(tài)的平衡，在線粒體hTERT保護線粒體DNA(mtDNA)降低線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）進而維持細胞的活性是細胞受到刺激后自我修復的重要機制之一。
　　核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（Nucl

4、ear factor kappa B NF-κB）是一種重要的轉(zhuǎn)錄激活因子。其主要參與機體防御反應，應激，細胞分化和凋亡等過程的信息傳遞。研究表明：NF-κB信號通路與hTERT的表達密切相關。NF-κB信號通路激活可以通過核轉(zhuǎn)位結合hTERT啟動子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平hTERT含量。在我們課題組前期的實驗中表明NF-κB抑制后可有效減少hTERT在肺癌中的表達，并對肺癌細胞的生長產(chǎn)生影響。那么NF-κB信號通路是否對細胞高ROS下hTERT線

5、粒體轉(zhuǎn)位有影響呢？這成為我們研究的重點。
　　本課題中用抗氧化劑二硫代氨基甲酸吡咯烷（Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate PDTC）來抑制NF-κB信號通路。研究NF-κB信號通路對肺癌細胞株H1299高氧化應激條件下hTERT線粒體轉(zhuǎn)位中的作用。完善hTERT核-線粒體轉(zhuǎn)位并保護線粒體功能完整的機制。
　　研究內(nèi)容和方法：
　　1．Real Time RT-PCR、Western

6、Blot技術檢測NF-κB信號通路活性抑制時高氧化應激狀態(tài)下對細胞hTERTmRNA和蛋白的表達情況
　　2．免疫熒光、Western Blot技術檢測NF-κB信號通路活性抑制時高氧化應激狀態(tài)下對細胞hTERT核-線粒體轉(zhuǎn)位的影響
　　3．Real Time RT-PCR、Western Blot技術檢測NF-κB信號通路主要蛋白P65與hTERT轉(zhuǎn)位之間的關系
　　結果：
　　1. Real Time RT-

7、PCR、Western Blot技術檢測結果表明：在高氧化應激狀態(tài)下hTERTmRNA和蛋白的表達量明顯增加，而抑制 NF-κB信號通路活性后hTERTmRNA和蛋白的表達量沒有明顯增加；
　　2. 線粒體蛋白Western Blot結果提示：在高氧化應激狀態(tài)下hTERT向線粒體轉(zhuǎn)位，抑制NF-κB信號通路活性后高氧化應激狀態(tài)下hTERT線粒體轉(zhuǎn)位減少；
　　3. 免疫熒光結果提示：在高氧化應激狀態(tài)下 hTERT向線粒體轉(zhuǎn)位

8、，抑制NF-κB信號通路活性后hTERT線粒體轉(zhuǎn)位減少；
　　4．Real Time RT-PCR、Western Blot技術檢測結果提示：在高氧化應激條件下hTERT向線粒體轉(zhuǎn)位NF-κB P65 mRNA、蛋白表達增加。
　　結論：
　　1. NF-κB信號通路活性的抑制能夠下調(diào)高氧化應激引起的hTERT高表達；
　　2. NF-κB信號通路活性的抑制可以減少hTERT的線粒體轉(zhuǎn)位；
　　3. NF-