產(chǎn)酶溶桿菌第二信使C-dI-GMP合成相關(guān)基因lys385的克隆及功能分析.pdf

1、產(chǎn)酶溶桿菌（Lysobacter enzymogenes）屬于黃單胞科(Xanthomonadaceae)、溶桿菌屬(Lysobacter)，是一種不同于芽孢桿菌和假單胞桿菌的重要生防革蘭氏陰性細(xì)菌。該菌能產(chǎn)生多種胞外水解酶，包括幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和蛋白酶，以及小分子次生抗菌代謝產(chǎn)物，對(duì)植物病原真菌、卵菌和陽性細(xì)菌均有較好的抗菌活性。熱穩(wěn)定抗真菌因子HSAF和抗細(xì)菌物質(zhì)WAP-89294A2是產(chǎn)酶溶桿菌產(chǎn)生兩種新型小分子抗菌物質(zhì)，分別對(duì)

2、絲狀真菌和卵菌，以及革蘭氏陽性細(xì)菌具有廣譜抗菌活性。目前這兩種小分子抗菌物質(zhì)在產(chǎn)酶溶桿菌體內(nèi)的生物合成途徑已經(jīng)得到研究，但它們生物合成的遺傳調(diào)控機(jī)制并未完全解析。
　　環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)是細(xì)菌中的一種新型第二信使，由2分子GTP在具有GGDEF保守結(jié)構(gòu)域的鳥苷酸環(huán)化酶(DGCs)的催化下合成，并可被含有EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶(PDEs)降解。已研究報(bào)道的DGCs和PDEs，通常都在N端存在一個(gè)或多個(gè)與信

3、號(hào)接收與傳遞相關(guān)的結(jié)構(gòu)域（如PAS和GAF等）。當(dāng)這些結(jié)構(gòu)域感應(yīng)胞內(nèi)外某種或某些信號(hào)后，會(huì)激活或抑制相應(yīng)PDEs或DGCs的活性，從而改變胞內(nèi)c-di-GMP含量，進(jìn)而通過c-di-GMP下游特異的受體來調(diào)控細(xì)菌一系列重要的生理生化功能，如細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性、生物膜形成以及致病性。該第二信使在生防細(xì)菌抗菌產(chǎn)物生物合成中的調(diào)控功能研究只在革蘭氏陽性細(xì)菌中被報(bào)道，在革蘭氏陰性細(xì)菌中缺乏相應(yīng)的研究。
　　本研究以具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)酶溶桿菌菌

4、株OH11為對(duì)象，旨在解析c-di-GMP介導(dǎo)的信號(hào)途徑在小分子抗菌物質(zhì)HSAF和WAP-8294A2生物合成中的功能。本研究通過全基因組掃描，鑒定了1個(gè)與c-di-GMP合成相關(guān)的基因，命名為L(zhǎng)ys385。Lys385蛋白的N端含有一個(gè)cNMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其在產(chǎn)酶溶桿菌細(xì)胞內(nèi)能結(jié)合某種核苷酸;其C端含有1個(gè)GGDEF結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其具有DGCs活性，參與c-di-GMP的合成。為探索該基因在HSAF和WAP-8294A2生物合成中調(diào)

5、控功能，我們利用基因同源重組原理，構(gòu)建了lys385的框內(nèi)缺失突變體，同時(shí)構(gòu)建了相應(yīng)的互補(bǔ)菌株及過表達(dá)菌株。定量檢測(cè)結(jié)果表明:lys385的缺失不影響HSAF和WAP-89294A2的產(chǎn)量，推測(cè)在所測(cè)條件下該基因并不參與HSAF和WAP-8294A2的生物合成，但是過表達(dá)菌株可提高HSAF產(chǎn)量。同時(shí)，在HSAF和WAP-8294A2的產(chǎn)生條傳下，lys385的缺失或過量表達(dá)也不改變產(chǎn)酶溶桿菌對(duì)植物病原真菌（水稻紋枯病菌）的抗菌活性。為探