蓋塔病毒分子特征及其感染的相關(guān)研究.pdf

1、目的：
　　測定新分離病毒株（YN12031,YN12042）的全基因組序列，驗(yàn)證其是否為蓋塔病毒(Getah virus，GETV)，研究新分離病毒株（YN12031）的生物學(xué)表型和分子遺傳學(xué)特征；構(gòu)建蓋塔病毒基因序列分析數(shù)據(jù)集，對(duì)蓋塔病毒的種群特征和時(shí)空動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析；最后分析蓋塔病毒在中國大陸的感染情況。
　　方法：
　　第一部分
　　將新分離的病毒株（YN12031）接種在BHK-21細(xì)胞上觀察細(xì)胞病變效

2、應(yīng)（CPE），并在透射電子顯微鏡下鑒定該病毒的形態(tài)，用噬斑測定法檢測病毒增殖的動(dòng)態(tài)變化。
　　設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增和測定全基因組序列的引物，使用PCR方法進(jìn)行基因序列擴(kuò)增。使用DNASTAR軟件包中的Seqman軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行拼接和質(zhì)量分析，使用ClustalX1.8軟件進(jìn)行序列比對(duì)，使用MEGA6.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育和分子進(jìn)化分析。
　　第二部分
　　在基因庫中下載蓋塔病毒序列，結(jié)合新分離的蓋塔病毒（YN12031,YN12

3、042病毒株）基因序列，以及15株本實(shí)驗(yàn)室此前在中國分離和鑒定、但未在GenBank登錄的蓋塔病毒毒株基因序列信息，用生物信息學(xué)方法構(gòu)建GETV序列分析數(shù)據(jù)集。
　　采用蒙特卡洛馬爾科夫鏈（MCMC）統(tǒng)計(jì)算法分析蓋塔病毒數(shù)據(jù)集。利用BEAET軟件包進(jìn)行堿基替換速率、最近共同祖先（Time of most recent Ancestor， tMRCA）以及種群動(dòng)態(tài)分析（Beast skyride plot，BSP）；采用BEAST

4、v1.8.1軟件包里的Bayesian Stochastic Search Variable Selection（BSSVS）程序進(jìn)行蓋塔病毒的空間動(dòng)力學(xué)研究；使用VMD軟件和YASARA軟件分析GETV E2蛋白的結(jié)構(gòu)。
　　第三部分
　　利用空斑減少中和實(shí)驗(yàn)的方法檢測人和多種動(dòng)物（雞、鴨、牛、豬、馬）血清標(biāo)本蓋塔病毒中和抗體水平。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　YN12031病毒株感染BHK-21細(xì)胞3

5、2小時(shí)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變。病毒粒子呈圓形，直徑70nm左右，有包膜，表面有纖突。
　　分子遺傳分析顯示，YN12031病毒與甲病毒屬病毒如基孔肯雅病毒，辛德畢斯病毒密切相關(guān)，并與GETV原型株MM2021處于同一進(jìn)化分枝中，蓋塔病毒E2基因和Capsid基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析進(jìn)一步顯示，YN12031病毒與俄羅斯分離蓋塔病毒處于同一進(jìn)化分枝，此外蓋塔病毒編碼區(qū)基因及E2基因同源性分析顯示，YN12031病毒與俄羅斯分離蓋塔病毒同源

6、性關(guān)系最近。
　　第二部分
　　蓋塔病毒 E2基因的氨基酸差異分析顯示，與1955年馬來西亞原始株（MM2021）相比，其他蓋塔病毒分離株均存在7個(gè)共同的氨基酸差異位點(diǎn)，這7個(gè)共同位點(diǎn)的突變，導(dǎo)致GETV流行株與原始毒株在結(jié)構(gòu)和電荷分布有差異。
　　蓋塔病毒最早出現(xiàn)在距今約145年前，隨后逐漸演化出四個(gè)明顯的進(jìn)化種群，GroupIII進(jìn)化種群是目前國際上在多種蚊蟲和宿主動(dòng)物中流行的，并能引起動(dòng)物疾病的優(yōu)勢病毒進(jìn)化種群。

7、
　　蓋塔病毒種群進(jìn)化動(dòng)態(tài)分析顯示，蓋塔病毒種群動(dòng)態(tài)經(jīng)過平緩—增長—下降—平緩的種群變化過程。
　　蓋塔病毒的播散存在頻繁的遷徙事件，馬來西亞、日本和云南是蓋塔病毒的重要遷徙源泉地區(qū)，遷徙事件也是蓋塔病毒重要的分布分化機(jī)制。
　　第三部分
　　共檢測了中國大陸895份人、畜動(dòng)物血清標(biāo)本，其中發(fā)熱患者血清中GETV中和抗體陽性率為8.4％(37/443)；禽類動(dòng)物GETV中和抗體陽性率明顯低于豬、馬；同樣為牛（ca

8、ttle），奶牛和菜牛對(duì)GETV中和抗體陽性率存在巨大差異。
　　發(fā)熱患者血清標(biāo)本GETV中和抗體水平從1:10至1:320不等；雞、鴨和奶牛血清標(biāo)本中僅可以檢測到低滴度（1:10至1:20）蓋塔病毒中和抗體；而絕大多數(shù)豬、馬、菜牛血清標(biāo)本可以檢測到1:640至大于1:2560滴度的蓋塔病毒中和抗體。
　　結(jié)論：
　　1測定了新分離病毒株YN12031,YN12042的全基因組序列，并證實(shí)了病毒株為GETV；生物學(xué)表型

9、顯示：GETV（YN12031分離株）可引起明顯的細(xì)胞病變，病毒粒子呈圓形，直徑70nm左右，有包膜，表面有纖突；分子遺傳分析顯示：YN12031病毒與俄羅斯分離蓋塔病毒同源性關(guān)系最近。
　　2成功構(gòu)建了GETV序列分析數(shù)據(jù)集，生物信息學(xué)分析顯示：GETV流行株和原始株之間存在結(jié)構(gòu)和電荷的變化；GETV最早出現(xiàn)在距今約145年前，隨后逐漸演化出四個(gè)明顯的進(jìn)化種群，GroupIII進(jìn)化種群是主要的優(yōu)勢病毒進(jìn)化種群；GETV種群動(dòng)態(tài)經(jīng)