肝臟為γδT細(xì)胞胸腺外發(fā)育場所的初步驗(yàn)證.pdf

1、目的:肝臟不僅是重要的代謝器官，而且也是一個(gè)免疫器官。肝臟中富含天然免疫細(xì)胞，其獨(dú)特的免疫細(xì)胞組成對于其功能特點(diǎn)的形成具有重要作用。許多研究表明，成年個(gè)體肝臟中含有造血干細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)輸回體內(nèi)后能發(fā)育為各類免疫細(xì)胞，并且能長期維持。因此，成年肝臟也被認(rèn)為具有造血功能的器官，尤其是在骨髓造血功能受到破壞或抑制時(shí)，其可能成為機(jī)體代償性造血的髓外造血器官。但該作用和機(jī)制尚需深入的研究和證實(shí)。肝臟獨(dú)特的造血功能是否會(huì)影響肝臟微環(huán)境中免疫細(xì)胞的組成

2、和發(fā)育分化，該領(lǐng)域尚少有人涉足。
　　肝臟免疫系統(tǒng)的特點(diǎn)之一是富含NKT、NK與γδT細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞。近年來的研究表明，肝臟中存在一群肝臟駐留的NK細(xì)胞，與經(jīng)典的NK細(xì)胞在表型、分布、功能與發(fā)育等方面存在巨大差異，認(rèn)為其可能由肝臟造血細(xì)胞發(fā)育而來。許多研究也表明，γδT細(xì)胞存在胸腺外發(fā)育途徑，小腸是其發(fā)育場所之一。鑒于γδT細(xì)胞在肝臟淋巴細(xì)胞中所占比例明顯高于脾臟、淋巴結(jié)及外周血，那么，肝臟是否也可能是γδT細(xì)胞胸腺外發(fā)育場所

3、，從而進(jìn)一步影響肝臟γδT細(xì)胞的組成？為了探討這些問題，本課題在確定肝臟相對于其他免疫器官富含γδT細(xì)胞的基礎(chǔ)上，從四個(gè)方面進(jìn)行了研究。首先，檢測比較了肝臟中CD4CD8雙陰性T前體細(xì)胞(DN1-DN4)的含量，觀察肝臟中T前體細(xì)胞含量變化的時(shí)間動(dòng)力學(xué)變化。發(fā)現(xiàn)肝臟的確存在T前體細(xì)胞，且以DN1和DN2細(xì)胞居多。其次，通過體外培養(yǎng)和過繼轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)，在功能上驗(yàn)證肝臟中T前體細(xì)胞是否具有向γδT細(xì)胞發(fā)育的潛能。再次，檢測了肝臟中是否含有向γδ

4、T細(xì)胞定向分化的γδT前體細(xì)胞，進(jìn)一步觀察其是否具有不同于胸腺γδT前體細(xì)胞的表型和功能特點(diǎn)。最后，通過γδT細(xì)胞亞群的分布、細(xì)胞表型以及在鼠傷寒桿菌感染時(shí)應(yīng)答特點(diǎn)，初步研究了肝臟γδT細(xì)胞的表型和功能特點(diǎn)。
　　方法:
　　1、分離提取肝臟、小腸、、皮膚、胸腺、脾臟與淋巴結(jié)內(nèi)的單個(gè)核細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測其中γδT細(xì)胞的比例。
　　2、通過PMA與離子霉素體外刺激，流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肝臟、胸腺與脾臟中γδT17與γ

5、δT1細(xì)胞亞群組成的時(shí)間動(dòng)力學(xué)變化曲線。
　　3、通過流式細(xì)胞術(shù)檢測各組織中T前體細(xì)胞的含量及肝臟中DN1-DN2的時(shí)相變化。
　　4、通過流式細(xì)胞術(shù)檢測肝臟中γδT前體細(xì)胞的表型、轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與細(xì)胞因子的分泌。
　　5、通過OP9-DL1誘導(dǎo)培養(yǎng)與過繼轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)，觀察肝臟或胸腺來源的T前體細(xì)胞向γδT細(xì)胞發(fā)育的能力。
　　6、通過灌胃感染建立鼠傷寒沙門氏菌感染模型，流式細(xì)胞術(shù)檢測肝臟γδ T細(xì)胞的活化與細(xì)胞因子

6、的分泌情況。
　　結(jié)果:
　　1、肝臟γδT細(xì)胞的比例顯著高于胸腺、脾臟與淋巴結(jié)。γδT17細(xì)胞的比例在胸腺中隨著周齡的增加逐漸下降，在脾臟與肝臟中則逐漸升高。胸腺與肝臟中γδT1細(xì)胞的比例與周齡無明顯聯(lián)系，脾臟中隨著周齡的增加逐漸下降。
　　2、與野生小鼠相比，無胸腺裸鼠肝臟中γδT細(xì)胞雖然比例明顯下降，但仍存在一定數(shù)量的γδT細(xì)胞，且具有分泌細(xì)胞因子的能力;而脾臟中γδT細(xì)胞幾乎不存在。
　　3、無胸腺裸鼠與

7、野生小鼠肝臟中存在大量T前體細(xì)胞DN1與DN2細(xì)胞。DN2細(xì)胞從小鼠出生后第2周開始在肝臟中逐漸出現(xiàn)，在第4周時(shí)其比例達(dá)到最高峰。與胸腺DN2細(xì)胞相比，肝臟DN2細(xì)胞高表達(dá)CD117、低表達(dá)CD90與CD25。
　　4、成年小鼠肝臟中存在CD24hiCD73+γδT前體細(xì)胞，其比例隨著周齡增加逐漸升高。成年小鼠肝臟CD24hiCD73+γδT前體細(xì)胞具有較強(qiáng)地分泌細(xì)胞因子的能力，高表達(dá)CD44、轉(zhuǎn)錄因子T-bet與RORγt，低表

8、達(dá)CD27。
　　5、通過與OP9-DL1細(xì)胞共孵育，肝臟來源的DN1細(xì)胞可以發(fā)育為γδT細(xì)胞，且比例較胸腺來源的DN1或DN2細(xì)胞高。體內(nèi)過繼轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)顯示，肝臟來源的DN2細(xì)胞可以發(fā)育為γδT前體細(xì)胞與成熟γδT細(xì)胞。
　　6、肝臟中γδT細(xì)胞的表型特點(diǎn)是低表達(dá)CD27、高表達(dá)CD44。成年小鼠肝臟γδT細(xì)胞主要為γδT17細(xì)胞，小腸γδT細(xì)胞以γδT1細(xì)胞占優(yōu)勢，脾臟或胸腺中無亞群特異性分布。
　　7、在鼠傷寒沙門

9、氏菌感染第3天時(shí)，肝臟中γδT細(xì)胞分泌IL-17a的比例已明顯升高。在感染第5天時(shí)，肝臟中γδT細(xì)胞CD69表達(dá)明顯升高，且分泌IFN-γ的比例也明顯升高。
　　結(jié)論:
　　1、除小腸與皮膚外，肝臟含有相對豐富的γδT細(xì)胞。
　　2、肝臟中存在γδT前體細(xì)胞，且具有獨(dú)特表型和功能特點(diǎn)。
　　3、肝臟T前體細(xì)胞DN1或DN2細(xì)胞具有向γδT細(xì)胞發(fā)育的能力。肝臟可能為γδT細(xì)胞胸腺外發(fā)育分化的場所。
　　4、肝