干擾素調(diào)節(jié)因子-1對(duì)急性冠脈綜合征患者Th分化影響及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分，目的：干擾素調(diào)節(jié)因子-1（IRF-1）在多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，廣泛參與了免疫調(diào)控過程。本研究通過研究IRF-1在急性冠脈綜合征（ACS）患者外周血CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)的變化，探討其在動(dòng)脈粥樣硬化（AS）中的可能作用。
　　 方法：分離冠心病患者包括穩(wěn)定型心絞痛（SA）組、不穩(wěn)定型心絞痛（UA）組、急性心肌梗死（AMI）組及胸痛綜合征（CPS）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠法分選CD4+T細(xì)胞，

2、以實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測各組細(xì)胞IRF-1mRNA表達(dá)水平，western-blot法檢測各組細(xì)胞IRF-1蛋白表達(dá)水平的變化。ELISA 法檢測各組患者外周血血清中Th1型細(xì)胞因子干擾素（IFN）-γ、腫瘤壞死因子（TNF）-α和白介素（IL）-12及Treg 相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1和IL-10表達(dá)，Pearson 相關(guān)分析進(jìn)行IRF-1表達(dá)與上述細(xì)胞因子水平的相關(guān)性研究。
　　 結(jié)果：ACS患者（包括UA、

3、AMI組）外周血CD4+T細(xì)胞中IRF-1表達(dá)明顯高于SA及CPS患者（p<0.05）。ACS患者外周血血清中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ及TNF-α表達(dá)較之SA和CPS患者明顯增高，Treg 相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β1和IL-10水平顯著下降(p<0.05)。相關(guān)分析結(jié)果表明IRF-1mRNA及蛋白表達(dá)與IFN-γ及TNF-α表達(dá)呈顯著正相關(guān)，反之，與TGF-β1和IL-10水平呈顯著負(fù)相關(guān)。(p<0.05)。
　　 結(jié)論：ACS

4、患者外周血CD4+T細(xì)胞IRF-1表達(dá)明顯增加，且其表達(dá)與ACS患者外周血血清Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α表達(dá)呈顯著正相關(guān)，與Treg 相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β1和IL-10水平呈顯著負(fù)相關(guān)，提示IRF-1是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化炎癥發(fā)展的轉(zhuǎn)錄因子，在ACS的發(fā)生中起重要作用。
　　 第二部分，目的：Th在ACS的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要的作用。本部分的主要目的是研究體外合成的IRF-1siRNA對(duì)ACS患者體外培養(yǎng)外周血Th1和

5、Treg 功能的影響。
　　 方法：體外合成4個(gè)IRF-1siRNA 序列，分別以lipofetamine2000將其和unrelatedsiRNA 轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的ACS患者外周血CD4+T細(xì)胞。通過實(shí)時(shí)定量PCR和western-blot技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)IRF-1mRNA和蛋白表達(dá)，成功篩選出最有效的IRF-1siRNA序列。分離培養(yǎng)12例ACS患者外周血CD4+T細(xì)胞，將培養(yǎng)CD4+T細(xì)胞分為3組：空白組，IRF-1siRN

6、A組，unrelated siRNA組，后兩者分別以lipofetamine2000成功轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的IRF-1siRNA，unrelated siRNA 序列片段，以三色流式法檢測Th1及CD4+CD25+Foxp3+Treg 比例。以植物血凝素（PHA）刺激培養(yǎng)CD4+T細(xì)胞，ELISA法檢測培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12p70表達(dá)水平，實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測IFN-γ、TNF-α、IL-12p35、IL-12

7、p40表達(dá)。流式分選CD4+CD25+T細(xì)胞，及CD4+CD25-T細(xì)胞，并在PHA 刺激下共培養(yǎng)，MTT 法檢測T淋巴細(xì)胞的增殖能力。
　　 結(jié)果：在本實(shí)驗(yàn)中成功篩選能有效抑制IRF-1表達(dá)的IRF-1siRNA, 以IRF-1siRNA沉默ACS患者外周血CD4+T細(xì)胞中IRF-1表達(dá)后，其Th細(xì)胞分化為Th1明顯抑制，主要表現(xiàn)為Th1比例顯著下降，Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)及蛋白分泌均

8、明顯減少。反之，CD4+細(xì)胞分化為Treg 明顯增加，主要表現(xiàn)為CD4+CD25+Foxp3+Treg 比例明顯增加，CD4+CD25+Treg對(duì)PHA 刺激條件下的CD4+CD25-T細(xì)胞增殖的抑制能力顯著增高。而unrelated siRNA對(duì)上述指標(biāo)影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：IRF-1siRNA 可以顯著抑制ACS患者外周血CD4+T細(xì)胞分化為Th1，促進(jìn)其向Treg分化，并影響炎癥細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、

9、IL-12的合成及T淋巴細(xì)胞的增殖，進(jìn)而參與ACS的發(fā)生發(fā)展。
　　 第三部分，目的：IRF-1是參與免疫調(diào)控的重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用并影響其功能。本部分的主要目的是研究IRF-1siRNA對(duì)Th1信號(hào)通路中IL-12Rβ1及T-bet和CD4+CD25+Treg 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)的影響，從而闡明IRF-1影響Th1及CD4+CD25+Treg分化的可能機(jī)制。
　　 方法：分離培養(yǎng)12例急性

10、冠脈綜合征患者外周血CD4+T細(xì)胞，將培養(yǎng)CD4+T細(xì)胞分為3組：ACS組，IRF-1siRNA組，unrelated siRNA組，后兩者分別以lipofetamine2000成功轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的IRF-1siRNA，unrelated siRNA 序列片段，同時(shí)以PHA 刺激培養(yǎng)CD4+T細(xì)胞，Th1信號(hào)通路中IL-12Rβ1及T-bet和CD4+CD25+Treg 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)。
　　 結(jié)果：以IRF-1siR

11、NA 沉默急性冠脈綜合征患者外周血CD4+T細(xì)胞中IRF-1表達(dá)后，體外培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞中Th1信號(hào)通路中IL-12Rβ1及T-bet表達(dá)明顯抑制，而CD4+CD25+Treg 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 增加。Unrelated siRNA對(duì)上述指標(biāo)影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：IRF-1siRNA 影響Th細(xì)胞相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達(dá)是其調(diào)節(jié)不同亞群Th細(xì)胞功能的可能機(jī)制，進(jìn)一步揭示IRF-1在急性冠脈綜合征免疫炎癥過程的重