健康人、腹瀉兒童與鼠形動物腸道肺炎克雷伯菌的病原學特征和耐藥性分析.pdf

1、目的：
　　比較和分析不同來源（動物、病人與健康人）腸道中肺炎克雷伯菌的血清型、基因型以及耐藥特征，探究在社區(qū)環(huán)境中，鼠形動物攜帶的肺炎克雷伯菌與人群分離的耐藥性與高毒力菌株之間的關系，為更好地預防和控制多重耐藥和高毒力肺炎克雷伯菌引起的社區(qū)獲得性感染提供基礎數據。
　　方法：
　　(1)2015年5-9月，在廣東省南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院檢驗科連續(xù)收集健康人與兒科門診腹瀉兒童的糞便樣本，將收集的糞便樣本置于運送培養(yǎng)基

2、于(2～8)℃暫時保存當天運送回實驗室，同時采集健康人和門診腹瀉兒童的基本信息;
　　(2)同時期，在廣東省白云區(qū)南方醫(yī)院及其附件以及周圍居民區(qū)（約為65萬平方米范圍）按照《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準》(SN/T2788-2011)相關標準利用籠捕法捕鼠。鼠籠布置地點為建筑物墻邊、下水道、垃圾堆、倉庫、廚房、垃圾桶、水溝等地點;以“晚放晨收”形式每月捕鼠一次，連續(xù)捕鼠5個月;捕獲的鼠形動物按要求立即運送至實驗室，按照《實

3、驗動物細菌學檢測標本采集》(GB/T14926.42-2001)要求解剖并采集鼠形動物糞便樣本;
　　(3)所有收集的糞便樣本按照《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準》(SN/T2788-2011)相關標準分離肺炎克雷伯菌，根據2014年美國臨床和實驗室標準協會制定的抗菌藥物敏感性試驗標準（CLSI標準）采用紙片擴散法(K-B法)對氨芐西林、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢替坦、頭孢呋辛、頭孢他啶、阿莫西林-克拉維酸

4、、氨曲南、慶大霉素、阿米卡星、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、復方新諾明、氯霉素、呋喃妥因、美羅培南共19種抗菌藥物進行敏感性試驗，依照2014年CLSI標準篩檢產ESBLs菌株，同時利用聚合酶鏈式反應(PCR)實驗方法檢測產ESBLs菌株中SHV、TEM和CTX-M三種耐藥基因;
　　(4)對分離培養(yǎng)的所有肺炎克雷伯菌利用細菌DNA基因組提取試劑盒提取核酸，通過PCR實驗方法篩檢高毒力肺炎克雷伯菌莢膜血清型（包括K1、K2、K5、K

5、20、K54和K57六種血清型），同時對該六種高毒力血清型菌株進行藥敏試驗，通過PCR實驗方法檢測該六種高毒力血清型菌株中magA、wcaG、rmpAuge、 kfu和Aerobactin六種毒力基因;根據MLST官網的參考文獻的實驗方法進行MLST分析。
　　(5)全部數據整理并且輸入Excel表格，采用SPSS20.0版軟件進行匯總分析。采用x2檢驗（或Pearson Chi-Square或Fisher's Exact Tes

6、t）進行率的比較，以P＜0.05作為有顯著性差異的判定標準。
　　結果：
　　(1)2015年5-9月期間，共收集健康人糞便樣本275份、腹瀉兒童糞便樣本105份，肺炎克雷伯菌檢出率分別為66.2％(182/275)和65.7％(69/105)。共捕獲鼠形動物190只，包括105只鼩鼱、80只褐家鼠、3只小家鼠和2只黃胸鼠，捕獲率為26.8％;鼩鼱捕獲率高于褐家鼠、小家鼠和黃胸鼠(x2=189.834，P＜0.001)，褐家

7、鼠捕獲率顯著高于其他家鼠(x2=147.225，P＜0.001)，然而鼩鼱與褐家鼠的捕獲率差異無統(tǒng)計學意義。肺炎克雷伯菌在鼠形動物糞便樣本檢出率為78.4％(149/190)，小家鼠和黃胸鼠糞便樣本中均未檢出肺炎克雷伯菌。鼠形動物腸道中肺炎克雷伯菌攜帶率高于健康人和腹瀉兒童(x2=9.266，P=0.010)。
　　(2)所有肺炎克雷伯菌均對氨芐西林耐藥。健康人糞便樣本檢出182株肺炎克雷伯菌的抗生素藥物敏感試驗結果:青霉素類抗生

8、素哌拉西林敏感率為19.2％;第一代頭孢類抗生素頭孢唑林敏感率為2.2％;第三代頭孢類抗生素頭孢噻肟、頭孢他啶敏感率為35.2％和65.4％;第四代頭孢類抗生素頭孢吡肟敏感率為54.4％;喹諾酮類、磺胺類、碳青霉烯類抗生素敏感性較高。腹瀉兒童糞便樣本所檢出69株肺炎克雷伯菌抗生素藥敏試驗結果:哌拉西林敏感率為19.2％;頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢他啶和頭孢吡肟敏感率分別為1.4％、46.4％、82.6％和69.6％;喹諾酮類、磺胺類、碳青

9、霉烯類抗生素敏感性較高。鼠形動物糞便樣本所檢出149株肺炎克雷伯菌對哌拉西林敏感率為10.7％;鼠形動物攜帶的肺炎克雷伯菌對頭孢唑啉耐藥情況嚴重，敏感率為3.4％;頭孢噻肟和頭孢他啶敏感率分別為36.9％和65.1％;頭孢吡肟敏感率為67.8％;喹諾酮類、磺胺類、碳青霉烯類抗生素敏感性較高。健康人、腹瀉兒童和鼠形動物腸道中肺炎克雷伯菌多重耐藥率分別為47.8％、29.0％和40.9％，其中腹瀉兒童多重耐藥率最低(x2=7.382，P=0

10、.025);三者產ESBLs菌株陽性率分別為17.0％、14.5％和10.7％，差異無統(tǒng)計學意義(x2=2.661，P=0.264)。對產ESBLs菌株進行耐藥基因檢測，產CTX-M和TEM型酶菌株陽性率分別為38.6％(22/57)和28.1％(16/57)(x2=1.421，P=0.233)，未檢出產SHV型酶菌株。在健康人、腹瀉兒童和鼠形動物中，TEM型檢出率沒有統(tǒng)計學意義上的差異(x2=5.585，P=0.061)，CTX-M型

11、在腹瀉兒童檢出率最高(x2=9.039，P=0.011)，但是，在健康人與鼠形動物樣本中檢出率差異沒有統(tǒng)計學意義(x2=0.032，P=0.858)。
　　(3)400株肺炎克雷伯菌經PCR檢測得，K1、K2、K5、K20、K54和K57六種高毒力肺炎克雷伯菌血清型檢出率分別為:1.0％、1.0％、1.5％、0.8％、0.5％和1.2％。其中，健康人和腹瀉兒童糞便樣本共檢出16株（檢出率為6.4％），K1、K2、K5、K20、K5

12、4和K57檢出率分別為1.6％、1.6％、0.4％、0.8％、0.8％和1.2％。在鼠形動物糞便樣本共檢出8株（檢出率為5.4％），K5、K20、K57檢出率分別為3.4％，0.7％和1.3％，未檢出K1、K2、K54血清型;所有K1和K2分離株對大部分抗生素敏感，然而K5、K20和K57分離株對青霉素類和第一代頭孢類抗生素耐藥嚴重，部份K5和K57分離株對第三代頭孢類抗生素耐藥。高毒力分離株毒力基因uge、kfu、wcaG、aerob

13、actin、rmpA和magA檢出率分別為95.8％、33.3％、29.2％、29.2％、29.2％和16.7％。magA基因僅存在于K1型分離株，而uge在六種血清型均可檢出。所有K1型分離株與K20、K54和K57部分分離株檢出wcaG基因。除了K2型分離株之外，其他血清型均可檢出kfu基因。在高毒力分離株中，大部分STs為首次出現的基因型，而臨床感染常見的ST23、ST86、ST37和ST65同時也在健康人和腹瀉兒童樣本中檢出，并

14、且首次在鼠形動物標本中檢出臨床患者常見的ST268基因型。
　　結論:
　　(1)健康人與腹瀉兒童腸道中肺炎克雷伯檢出率無統(tǒng)計學意義上的差異，但是二者的檢出率均低于鼠形動物腸道中肺炎克雷伯菌的檢出率。
　　(2)健康人、腹瀉兒童和鼠形動物糞便樣本中肺炎克雷伯菌分離株對青霉素類、頭孢類抗生素耐藥情況嚴重，特別是對第一代和第三代頭孢類抗生素，但對喹諾酮類、磺胺類、碳青霉烯類抗生素敏感率較高。鼠形動物與人類共處同一生活環(huán)境，

15、攜帶的肺炎克雷伯菌耐藥譜及耐藥基因型與健康人相似，提示鼠形動物可能成為多重耐藥肺炎克雷伯菌的儲存宿主和傳染源。
　　(3)雖然鼠形動物與人群樣本的肺炎克雷伯菌高毒力血清型分布不完全一致，但是部分高毒力血清型在鼠形動物以及人樣本中均能檢測到。在健康人和腹瀉兒童樣本中檢出K1、K2、K5、K20、K54和K57六種高毒力莢膜血清型，其中以K1、K2和K57檢出率較高;在鼠形動物糞便標本中，K5、K20和K57檢出率最高，但未檢出K1、

16、K2和K54型。K1和K2型分離株對大部分抗生素敏感，而K5、K20和K57型分離株對青霉素類和頭孢類抗生素耐藥率較高。magA是K1型菌株重要的毒力因子并且僅存在于K1型分離株;wcaG存在于K1、K20、K54和K57型分離株，與其強毒力有關;rmpA與aerobactin的平行關系提示二者可能協同發(fā)揮毒力作用。
　　(4)鼠形動物、健康人和腹瀉兒童腸道中均可以檢出作為社區(qū)獲得性感染重要病原體的高毒力肺炎克雷伯菌常見基因型，提