在小鼠模型中研究衰老對(duì)表皮朗格漢斯細(xì)胞發(fā)育和功能的影響.pdf

1、免疫老化是隨著年齡增長(zhǎng)機(jī)體免疫功能逐漸衰退的過(guò)程，老年皮膚可能由于新陳代謝的減慢及免疫系統(tǒng)功能的異常，更易引發(fā)感染、自身免疫病及皮膚腫瘤。朗格漢斯細(xì)胞（Langerhans cell，LC）是定居于皮膚的樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)亞群，是皮膚免疫反應(yīng)中重要的抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)，在調(diào)控皮膚免疫應(yīng)答中起著非常關(guān)鍵的作用。LC獨(dú)特的標(biāo)志是胞質(zhì)中含有一種網(wǎng)球拍型小顆粒，稱

2、為伯貝克顆粒（Birbeck granule），它參與抗原的捕獲和處理。攝取抗原后的LC遷至淋巴結(jié)，將抗原呈遞給T細(xì)胞，引發(fā)皮膚免疫反應(yīng)，從而在對(duì)抵抗侵入皮膚的病原微生物、監(jiān)視皮膚癌變細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。隨著衰老與皮膚免疫間關(guān)系研究的深入，衰老過(guò)程中LC發(fā)育和功能的變化也日益受到重視。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)是一類(lèi)功能復(fù)雜的多肽類(lèi)細(xì)胞因子超家族，Smad蛋白是TG

3、Fβ受體復(fù)合物下游的信號(hào)調(diào)節(jié)分子，可將活化信號(hào)由胞膜傳導(dǎo)至胞核而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。TGFβ/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是TGFβ發(fā)揮生物學(xué)作用的主要信號(hào)途徑，已參與多種免疫活性細(xì)胞如T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的發(fā)育和功能的調(diào)控，但在LC發(fā)育和功能的作用尚不清楚。
　　 衰老不僅影響機(jī)體獲得性免疫應(yīng)答，固有免疫在此過(guò)程中亦發(fā)生了明顯改變。目前大量研究顯示，衰老時(shí)不同組織、不同部位DC亞群的數(shù)量和功能發(fā)生了變化;但表皮LC，作為定居于皮膚的

4、DC亞群，在免疫老化過(guò)程中其功能會(huì)發(fā)生怎樣的變化，目前尚不十分清楚。
　　 同時(shí)，衰老是一個(gè)多因素引發(fā)的多個(gè)器官功能下降的過(guò)程，由于基因水平改變導(dǎo)致的細(xì)胞蛋白水平變化已經(jīng)成為此過(guò)程的重要因素之一。近幾年大量研究顯示:miRNA已參與機(jī)體免疫反應(yīng)的生理和病理過(guò)程。產(chǎn)生成熟miRNA必需的核酸酶ⅢDicer的敲除可使皮膚LC數(shù)量和功能明顯下降，這一結(jié)果表明miRNA參與LC的發(fā)育和功能的調(diào)控。重要的是，miRNA還參與體內(nèi)多種免疫細(xì)

5、胞如巨噬細(xì)胞等的老化過(guò)程，那么它是否參與了表皮LC的老化，在此過(guò)程中與老年LC功能變化又有著怎樣的關(guān)系，這需要在相應(yīng)的動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行深入研究。
　　 因此，本課題以研究LC發(fā)育的信號(hào)通路為切入點(diǎn)，利用基因敲除鼠和老齡鼠動(dòng)物模型，探討了TGFβ/Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在LC發(fā)育及功能中的作用、衰老對(duì)LC功能的影響、老年LCmiRNA表達(dá)譜的變化及其與LC功能改變的關(guān)系。本研究主要包括三部分的內(nèi)容:
　　 1.Smad

6、3在調(diào)控表皮LC發(fā)育的信號(hào)通路中的作用。
　　 首先我們使用Smad3敲除鼠模型驗(yàn)證TGFβ/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在LC發(fā)育中的作用。FACS分析不同年齡階段的Smad3KO和WT小鼠表皮LC數(shù)量的變化。結(jié)果顯示，與野生型小鼠(wild type，WT)相比，Smad3的缺陷對(duì)表皮LC發(fā)育在不同的年齡階段均沒(méi)有明顯影響，但新生鼠(0d)表皮中LC數(shù)量最少(0.78±0.11％)，且表達(dá)Langerin較低;出生后3d，Lange

7、rin的表達(dá)逐漸升高(70-80％)，此時(shí)表皮LC數(shù)量亦達(dá)到一個(gè)最高峰值(2.72±0.14％);出生5weeks后，表皮LC數(shù)量達(dá)到一個(gè)恒定水平，并保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)(1-2％)。免疫熒光染色觀察耳朵皮片中LC的分布及MHCⅡ分子和Langerin分子的表達(dá)。與FACS檢測(cè)結(jié)果相一致，新生鼠(0d)的表皮LC只表達(dá)MHCⅡ分子，不表達(dá)Langerin分子;而出生5weeks后，LC則同時(shí)表達(dá)MHCⅡ和Langerin分子。與相同年齡階段

8、WT小鼠相比，Smad3缺陷鼠的表皮LC細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有發(fā)生明顯變化(p＞0.05)。
　　 吞噬功能的強(qiáng)弱在一定程度上代表了DC的成熟度及功能狀態(tài)，我們接著觀察了Smad3對(duì)LC成熟度和吞噬抗原能力的影響。Smad3缺陷鼠表皮LC沒(méi)有自發(fā)成熟，且體外培養(yǎng)48h后，盡管LC高表達(dá)MHCⅡ及共刺激分子CD80、CD86，但與WT小鼠相比沒(méi)有顯著變化(p＞0.05)。進(jìn)一步分析LC吞噬抗原的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Smad3缺陷鼠與WT小鼠表皮L

9、C均有很強(qiáng)的吞噬能力，但兩者之間沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05)。
　　 以上結(jié)果表明，Smad3缺陷不影響表皮LC發(fā)育、成熟及吞噬能力，這提示我們TGFβ/Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不是TGFβ調(diào)控LC發(fā)育和功能必需的唯一的信號(hào)途徑，在此通路中Smad2可能替代Smad3作為胞內(nèi)信號(hào)蛋白介導(dǎo)TGFβ效應(yīng);或者TGFβ通過(guò)non-Smad蛋白信號(hào)通路在LC發(fā)育和功能中發(fā)揮生物學(xué)作用，這需要在相應(yīng)的動(dòng)物模型中進(jìn)一步深入探討。
　　

10、 2.衰老對(duì)表皮LC發(fā)育和功能的影響。
　　 LC是定居于皮膚的不成熟DC亞群，在調(diào)控皮膚免疫應(yīng)答中起著非常關(guān)鍵的作用。隨著衰老與皮膚免疫間關(guān)系研究的深入，衰老過(guò)程中LC發(fā)育和功能的變化也日益受到重視。首先我們觀察了不同年齡階段小鼠表皮LC數(shù)量的變化。FACS分析結(jié)果顯示，隨著年齡的增長(zhǎng)，與＜6個(gè)月小鼠(1.60±0.09％)相比，12個(gè)月小鼠LC數(shù)量(1.32±0.02％)顯著降低(p＜0.05），但與18個(gè)月小鼠(1.13

11、±0.10％)比較，沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05)。因?yàn)楸砥C數(shù)量的減少，移行至引流淋巴結(jié)中LC數(shù)量也相應(yīng)的降低，下降了2-3倍。但是表皮中γδT細(xì)胞從18個(gè)月小鼠開(kāi)始顯著降低，在＜6個(gè)月和12個(gè)月小鼠的表皮中沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05)。表皮中LC數(shù)量的顯著下降可能與LC自我更新能力有關(guān)，因此我們分析了代表核增殖能力的Ki67和壞死及凋亡標(biāo)志的AnnxinV/7-AAD表達(dá)比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組間無(wú)顯著性差異。這些結(jié)果提示隨年齡的老化

12、，LC數(shù)量的減少可能與局部LC前體細(xì)胞缺損或?qū)C祖細(xì)胞趨化能力下降有關(guān)。
　　 DC刺激T細(xì)胞活化、增殖發(fā)生免疫應(yīng)答的過(guò)程需要細(xì)胞表面的MHCⅡ和共刺激分子介導(dǎo)的細(xì)胞間接觸，因此我們觀察了衰老對(duì)表皮LC成熟度的影響。結(jié)果顯示，與年輕小鼠相比，老齡小鼠表皮LC體外培養(yǎng)48h后，低表達(dá)MHCⅡ、CD80及CD86分子，表明年齡老化對(duì)LC成熟有抑制作用。LC作為皮膚中與外界環(huán)境中不同物質(zhì)接觸的“哨兵”，能攝取、加工抗原，并遷移至局部

13、淋巴結(jié)，刺激初始T細(xì)胞，引起皮膚免疫應(yīng)答。因此，我們又檢測(cè)了LC吞噬抗原和遷移能力。與年輕小鼠相比，老齡小鼠表皮LC的吞噬能力顯著升高(p＜0.05）。既往研究顯示Langerin是LC中Birbeck顆粒的主要組成成分，其與攝取抗原能力有關(guān)，因此我們進(jìn)一步分析衰老對(duì)Langerin表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與吞噬抗原能力結(jié)果相對(duì)應(yīng)，老齡小鼠LC中Langerin的表達(dá)明顯上調(diào)(p＜0.05）。但是，LC在體內(nèi)的遷移能力，老齡小鼠和年輕小鼠

14、之間無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。
　　 DC的一個(gè)顯著特點(diǎn)是具有刺激T細(xì)胞增殖的能力。為探討LC的抗原提呈能力，我們將分選的LC與OTⅠ/OTⅡ肽特異的CD8+/CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察抗原肽特異的T細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，與年輕小鼠相比，老齡小鼠表皮LC刺激抗原肽特異的CD8+/CD4+T細(xì)胞增殖能力顯著下降(p＜0.05）。
　　 以上結(jié)果表明，衰老能導(dǎo)致小鼠表皮LC的數(shù)量減少、成熟度下降、吞噬抗原能力增高但抗原

15、提呈功能缺陷，那么免疫老化過(guò)程中，導(dǎo)致皮膚LC發(fā)育和功能缺陷的原因是什么呢，需要我們繼續(xù)探討研究。
　　 3.探索了miRNA與老年LC功能變化的關(guān)系。
　　 既往研究顯示miRNA參與老化過(guò)程中一些組織和細(xì)胞的功能調(diào)控，并且在LC的發(fā)育和功能中也發(fā)揮重要作用。為探討miRNA是否參與對(duì)老齡小鼠LC發(fā)育和功能的調(diào)控，我們應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)進(jìn)行老齡小鼠和年輕小鼠皮膚LC的miRNA表達(dá)譜研究，以期尋找老化LC特異的mi

16、RNA表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示，與年輕小鼠相比，老化LC的miRNA表達(dá)譜中，40個(gè)miRNAs表達(dá)明顯下降，13個(gè)miRNAs表達(dá)顯著上調(diào)(foldchange＞3)。
　　 為驗(yàn)證基因芯片數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，挑選具有代表性的miR-709、miR-449等單獨(dú)做實(shí)時(shí)定量PCR以驗(yàn)證其表達(dá)水平。同時(shí)snoRNA135及snoRNA202被用作內(nèi)對(duì)照基因。結(jié)果顯示，miR-709等表達(dá)變化在單個(gè)PCR中得到驗(yàn)證，雖然其變化幅度小于基因陣列檢

17、測(cè)結(jié)果，考慮到基因陣列與單個(gè)PCR的不同，該差異仍在可接受范圍內(nèi)。為進(jìn)一步探討miRNA與老年LC功能變化的關(guān)系，我們運(yùn)用Target Scan Mouse6.2數(shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)變化的miRNAs調(diào)控的靶分子在老化LC發(fā)育和功能中的作用。根據(jù)miRNA-gene網(wǎng)絡(luò)圖顯示:與老化相關(guān)的miRNAs調(diào)控的靶分子如TGFβ、Gii1、IRF8、RunX3及CSF1R等均通過(guò)不同信號(hào)通路參與LC發(fā)育和功能的過(guò)程。
　　 綜上所述，Smad3