油菜與擬南芥中兩個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因分別調(diào)控活性氧與茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制研究.pdf

1、MYB(myeloblastosis)轉(zhuǎn)錄因子家族作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。它們還調(diào)節(jié)次級(jí)代謝過(guò)程，例如苯丙烷類化合物的代謝;并調(diào)控對(duì)于多種生物和非生物逆境的響應(yīng)過(guò)程。同時(shí)，在不同的調(diào)節(jié)過(guò)程中，又有多種激素等信號(hào)通路參與，形成了復(fù)雜的的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。雖然，有關(guān)模式植物擬南芥中MYB的功能研究的報(bào)道頗多，但仍有很多MYB基因的功能未知。并且，與擬南芥同屬十字花科的甘藍(lán)型油菜（Brassica n

2、apusL.）的MYB基因的報(bào)道非常少。因此，有必要開展研究。
　　在本研究中，我們?cè)谇捌谟嘘P(guān)油菜R3R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的鑒定、cDNA克隆、轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)、亞細(xì)胞定位分析以及功能篩選的基礎(chǔ)上，較為系統(tǒng)地研究了BnaMYB78基因的功能與分子調(diào)控機(jī)制。BnaMYB78在煙草中瞬時(shí)的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species，ROS)的積累并誘發(fā)細(xì)胞死亡，并通過(guò)隨后的二氨基聯(lián)苯胺(3，3，-diamino

3、benzidine，DAB)染色、葉綠素、丙二醛、過(guò)氧化氫等的含量測(cè)定等一系列生理指標(biāo)的檢測(cè)證實(shí)了這一現(xiàn)象。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(quantitative real-time RT-PCR，qRT-PCR)分析顯示BnaMYB78在油菜衰老葉片里表達(dá)水平偏高。BnaMYB78是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活蛋白，定位于細(xì)胞核內(nèi)。并且，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR篩查發(fā)現(xiàn)，BnaMYB78的下游靶標(biāo)基因可能包括RbohB、PR2、PR5、GST、ACRE3

4、1、HIN1等，并進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告(dual-luciferase，dual-LUC)基因系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)BnaMYB78很可能與三種不同的MYB順式作用元件結(jié)合，并且驗(yàn)證了BnaMYB78對(duì)GST和HIN1具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　我們?cè)谠囼?yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員AtMYBx的過(guò)表達(dá)株系在黑暗誘導(dǎo)下幼苗衰老會(huì)提前，且正常生長(zhǎng)條件下葉片衰老也會(huì)提前。通過(guò)實(shí)時(shí)

5、熒光定量RT-PCR分析顯示AtMYBx的表達(dá)被JA顯著誘導(dǎo)。AtMYBx是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活蛋白，定位于細(xì)胞核內(nèi)。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)合電遷移變動(dòng)分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)試驗(yàn)表明，AtMYBx能結(jié)合三種不同的MYB順式作用元件。然后，檢測(cè)了茉莉酸和衰老相關(guān)的標(biāo)志基因在AtMYBx的突變體與過(guò)表達(dá)株系中的轉(zhuǎn)錄本水平，發(fā)現(xiàn)部分茉莉酸合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄本水平在A

6、tMYBx的過(guò)表達(dá)株系中發(fā)生了顯著地變化。并進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，驗(yàn)證了AtMYBx對(duì)部分基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。同時(shí)，又通過(guò)激素的定量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)AtMYBx過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致JA積累增加，說(shuō)明AtMYBx能夠正調(diào)控LOX2等茉莉酸合成相關(guān)基因，使植物體內(nèi)茉莉酸合成和積累增加，從而誘發(fā)植物提前衰老。
　　本研究不僅發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的分別調(diào)控活性氧與茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的R2R3-MYB型基因，明確了它們的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄活性等特性，而且對(duì)下游靶