油菜中兩個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控活性氧累積及細(xì)胞死亡的分子機(jī)制解析.pdf

1、農(nóng)作物的生長(zhǎng)、產(chǎn)量與品質(zhì)受環(huán)境中存在的許多不利因素的嚴(yán)重影響。面對(duì)這些挑戰(zhàn)，植物進(jìn)化出許多適應(yīng)機(jī)制。作為植物體中較大的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物體的生長(zhǎng)發(fā)育、生物及非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。雖然油菜是一種十分重要的油料作物，但是目前關(guān)于油菜中NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員的功能了解還很少。在本文中，我們對(duì)油菜中的兩個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因在活性氧(ROS)累積及細(xì)胞死亡過(guò)程中的功能與調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步研究。
　　首先，我

2、們從油菜中分離并克隆了BnaNAC56及BnaNACa基因，并發(fā)現(xiàn)BnaNAC56的表達(dá)受多種脅迫的誘導(dǎo)，如脫落酸(abscisic acid，ABA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、百草枯(methyl viologen，MV)以及腐生型真菌病原體核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）等;相反，BnaNAC56的表達(dá)受到冷害脅迫的誘導(dǎo)。亞細(xì)胞定位及雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)表明BnaNAC56定位于細(xì)胞核

3、內(nèi)而且是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子。煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)BnaNAC56基因以后，發(fā)現(xiàn)其能夠引起ROS累積以及類似超敏反應(yīng)的細(xì)胞死亡現(xiàn)象。隨后我們進(jìn)行了二氨基聯(lián)苯胺(3，3-diaminobenzidine，DAB)染色并測(cè)定了一系列與ROS及細(xì)胞死亡相關(guān)的生理指標(biāo)，如相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛、葉綠素以及H2O2等，這些結(jié)果均表明煙草葉片中出現(xiàn)ROS累積及細(xì)胞死亡現(xiàn)象。同時(shí)，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP粘性末端標(biāo)記法（TUNEL）以及DNA梯型分析試

4、驗(yàn)也表明BnaNAC56的表達(dá)誘導(dǎo)DNA片段化。此外，免疫印跡(Western blot)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BnaNAC56以及對(duì)照GFP確實(shí)在煙草葉片中表達(dá)，說(shuō)明煙草葉片出現(xiàn)的類似超敏反應(yīng)的細(xì)胞死亡確實(shí)由BnaNAC56蛋白誘發(fā)。為了進(jìn)一步確定BnaNA C56的功能，我們分離并制備了油菜原生質(zhì)體，并利用PEG4000介導(dǎo)的方式分別轉(zhuǎn)染BnaNAC56及GUS瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照GUS相比，表達(dá)BanNAC56的油菜原生質(zhì)體確實(shí)能

5、夠誘導(dǎo)ROS的累積以及細(xì)胞死亡。我們還進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR(real-time quantitative RT-PCR)試驗(yàn)，檢測(cè)了與ROS、細(xì)胞死亡、防御反應(yīng)相關(guān)的一些標(biāo)志基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)某些標(biāo)志基因的表達(dá)水平被顯著誘導(dǎo)，而且雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Dual-LUC assay)也表明這些被誘導(dǎo)表達(dá)的標(biāo)志基因確實(shí)能夠被BnaNAC56激活。以上結(jié)果表明，BnaNAC56能夠作為一個(gè)脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄激活子發(fā)揮功能并且在ROS累積及

6、細(xì)胞死亡調(diào)控過(guò)程中起到十分重要的作用。
　　類似地，我們開(kāi)展了有關(guān)BnaNACa的功能研究。首先，我們將其在煙草葉片中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)煙草葉片中出現(xiàn)與BnaNAC56類似的現(xiàn)象，即ROS累積和類似超敏反應(yīng)的細(xì)胞死亡。DAB染色結(jié)果顯示煙草葉片表達(dá)BnaNACa的部位出現(xiàn)了明顯的H2O2累積，而且H2O2含量的測(cè)定結(jié)果也顯示隨著B(niǎo)naNACa表達(dá)時(shí)間的延長(zhǎng)，H2O2的含量不斷增加。此外，葉綠素、丙二醛、花青素含量以及相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定