活性氧族在CHO細(xì)胞補(bǔ)料批次培養(yǎng)中的作用、機(jī)制及調(diào)控研究.pdf

1、單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)藥物因具有靶向性高、副作用小、療效持久等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為腫瘤治療的重要手段之一。截至2016年2月全球已有21個(gè)抗腫瘤單克隆抗體藥物獲批上市，用于多種實(shí)體瘤、血液腫瘤等的治療。如何進(jìn)一步提高抗體藥物的產(chǎn)量，以滿足日益擴(kuò)大的市場(chǎng)需求已成為亟待解決的技術(shù)難題。中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary，CHO）是目前抗體藥物產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用最廣泛、培養(yǎng)工藝最成熟的真核

2、宿主表達(dá)細(xì)胞。在CHO細(xì)胞工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡是在培養(yǎng)中后期導(dǎo)致活細(xì)胞密度下降，進(jìn)而影響單抗藥物表達(dá)量的主要因素之一。細(xì)胞有氧代謝過程中產(chǎn)生的活性氧族(reactive oxygen species，ROS)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，本課題旨在探究ROS在CHO細(xì)胞補(bǔ)料批次培養(yǎng)中的作用、機(jī)制和調(diào)控方式，從而有效提高單克隆抗體藥物的表達(dá)量。
　　本課題利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)批次培養(yǎng)中CHO細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果顯示隨著細(xì)胞密度的增長，R

3、OS水平迅速升高;當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到最高密度后細(xì)胞活率、活細(xì)胞密度均發(fā)生驟降。在CHO細(xì)胞批次培養(yǎng)中分別加入50、100、200μM過氧化氫(H2O2)，發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞均受到不同程度的生長抑制。這提示細(xì)胞內(nèi)ROS積累與生長衰退有一定關(guān)系。
　　本課題從兩個(gè)方面對(duì)CHO細(xì)胞培養(yǎng)中ROS水平進(jìn)行調(diào)控。首先是外源途徑，即在培養(yǎng)基中額外添加還原性物質(zhì)硫辛酸。在批次培養(yǎng)中分別向培養(yǎng)基中添加0、25、50、100與200μM硫辛酸，結(jié)果顯示100μ

4、M組活細(xì)胞密度積分(IVCD)最高，為54.65×106 cells/mL days，因此將補(bǔ)料批次培養(yǎng)中硫辛酸的添加濃度設(shè)為100μM。應(yīng)用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)對(duì)照組與硫辛酸組細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果顯示在培養(yǎng)第五至八天硫辛酸組細(xì)胞的ROS水平均顯著低于對(duì)照組;使用臺(tái)盼藍(lán)拒染法描記CHO細(xì)胞生長、活率圖，結(jié)果顯示在培養(yǎng)中后期，與對(duì)照組相比100μM硫辛酸組的活細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、IVCD均顯著增高;同時(shí)利用高效液相色譜法檢測(cè)培養(yǎng)終

5、末期對(duì)照組細(xì)胞上清抗體濃度為0.88 g/L，硫辛酸組濃度為1.04 g/L，表達(dá)量提高約18.0％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);在抗體表征方面，還原與非還原性SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，硫辛酸組細(xì)胞表達(dá)的單克隆抗體分子在二硫鍵修飾上與對(duì)照組一致;通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)抗體N-糖基化修飾，結(jié)果表明兩組的主要糖型種類及所占比例無顯著差異;同時(shí)我們通過Annexin V/PI法檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示在補(bǔ)料批次培養(yǎng)第八至十天硫辛酸組細(xì)

6、胞凋亡率均顯著低于對(duì)照組細(xì)胞，且western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)，培養(yǎng)后期對(duì)照組凋亡發(fā)生相關(guān)蛋白Caspase-7剪切體表達(dá)水平高于硫辛酸組細(xì)胞。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硫辛酸顯著降低了CHO胞內(nèi)ROS水平，抑制補(bǔ)料批次培養(yǎng)中后期細(xì)胞凋亡，提高了活細(xì)胞密度積分及單克隆抗體表達(dá)量。
　　第二方面是通過內(nèi)源途徑對(duì)ROS水平進(jìn)行調(diào)控。蘋果酸酶-1(malic enzyme1，ME-1)主要作用是催化胞漿內(nèi)蘋果酸氧化脫羧，此過程同時(shí)伴隨NADP

7、+的還原反應(yīng)。本課題利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了pcDNA3.0-ME-1真核表達(dá)載體，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后通過抗生素篩選得到穩(wěn)定表達(dá)ME-1基因的CHO細(xì)胞庫（CHO-ME-1 pool）。在CHO-ME-1細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的補(bǔ)料批次培養(yǎng)中，檢測(cè)顯示在對(duì)數(shù)生長期CHO-ME-1組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著低于對(duì)照組。細(xì)胞生長活率方面，從培養(yǎng)第八天直至培養(yǎng)終末期，CHO-ME-1組的活細(xì)胞密度、細(xì)胞活率均高于對(duì)照組，IVCD值提高了約33.0％，抗體表達(dá)量提

8、高了約16.9％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。抗體藥物表征研究結(jié)果顯示，CHO-ME-1細(xì)胞表達(dá)的抗體在分子量、二硫鍵修飾、N-糖基化修飾等方面與對(duì)照組沒有顯著差異，符合預(yù)期質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)中后期，CHO-ME-1組細(xì)胞凋亡率、Caspase-7活化剪切體的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組(p0.01)。
　　本課題發(fā)現(xiàn)，ROS的過量累積會(huì)對(duì)CHO細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制作用，通過建立內(nèi)源、外源兩種途徑可以有效降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，