新型核苷化合物FZY--80對非小細(xì)胞肺癌藥效學(xué)、藥代動力學(xué)及安全性評價.pdf

1、目的：
　　肺癌是中國和世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤。根據(jù)細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的形態(tài)特點及免疫組化將肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌的治療方案主要根據(jù)其臨床分期來制定。對Ⅰ、Ⅱ、ⅢA期以手術(shù)切除為主，對無法切除的ⅢA或ⅢB期、Ⅳ期的肺癌患者推薦放化療聯(lián)合、靶向治療及腫瘤免疫治療。在過去幾年中，肺癌靶向藥物的開發(fā)和應(yīng)用已取得了突破性進(jìn)展，對具有敏感驅(qū)動性基因突變的晚期非小細(xì)胞肺癌，特別是腺癌患者，已經(jīng)成為一線治療方案。但是

2、對于無敏感驅(qū)動性基因突變或者由于靶向治療藥物過于昂貴無法承擔(dān)的晚期非小細(xì)胞肺癌患者，一線方案仍是以鉑類為基礎(chǔ)的雙藥聯(lián)合化療為主。但是化療藥物的毒副作用及腫瘤細(xì)胞的耐藥性等極大地限制了其臨床上的應(yīng)用，因此非常有必要針對非小細(xì)胞肺癌研發(fā)出新的化療藥物。
　　核苷類藥物是一類重要的抗腫瘤藥物，比如5-氟尿嘧啶及其前藥、阿糖胞苷、阿扎胞苷、吉西他濱等。其主要作用是通過競爭性抑制DNA的相關(guān)合成酶來阻止腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，但

3、在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出部分的缺點:(1)脂溶性較差，進(jìn)入體內(nèi)后易被脫氨酶代謝而失去活性;(2)半衰期較短，生物利用度低;(3)腫瘤細(xì)胞耐藥。為解決這一難題，本課題組上海醫(yī)藥工程研究院的王震宇博士針對目前臨床上使用較為廣泛的抗腫瘤核苷類藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，對其結(jié)構(gòu)、形態(tài)、分子量等進(jìn)行了考察，然后通過廣泛篩選，挑選出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的、體內(nèi)外抗癌活性強(qiáng)、可以口服給藥的FZY-80為侯選開發(fā)化合物。
　　本研究旨在進(jìn)一步評價新型核苷類化合物F

4、ZY-80對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的體內(nèi)外抗腫瘤活性，并探討相關(guān)潛在的分子機(jī)制;評價FZY-80對小鼠的急性毒性、大鼠的長期毒性及其藥代動力學(xué)特征，推測FZY-80重復(fù)給藥的臨床毒性靶器官或靶組織，預(yù)測臨床試驗的起始劑量和重復(fù)用藥的安全劑量范圍，提示臨床試驗中需重點監(jiān)測的指標(biāo)。
　　第一部分 新型核苷化合物FZY-80藥效學(xué)研究
　　方法:
　　1.體外抗腫瘤活性評價:采用MTT法檢測化合物FZY-80對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株

5、A549作用72h后的增殖抑制作用;
　　2.體內(nèi)抗腫瘤作用:采用BalB/c裸鼠皮下接種A549細(xì)胞，待腫瘤長至100mm3左右，分別灌胃5、10和20mg/kg化合物FZY-80，測量腫瘤體積，計算抑瘤率。
　　結(jié)果:
　　1.體外抗腫瘤活性顯示化合物FZY-80呈濃度依賴性抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞增殖，其對A549細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)為66.9μM。同條件下測得吉西他濱作用于A549細(xì)胞的IC5

6、0為94.3μM，與對照藥吉西他濱相比，化合物FZY80表現(xiàn)出更好的抗肺癌活性;
　　2.荷瘤裸鼠灌胃5、10和20mg/kg化合物FZY-80后抑制率分別為25.77％、46.39％和59.79％。20mg/kg化合物FZY-80和陽性對照藥吉西他濱具有等同的抗腫瘤活性，且體重下降不超過10％，沒有表現(xiàn)出明顯毒性。
　　第二部分 新型核苷化合物FZY-80抗腫瘤機(jī)制初探
　　方法:
　　1.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測不

7、同劑量的FZY-80對腫瘤細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期的影響;
　　2.利用Western Blot檢測FZY-80對P21蛋白以及Bcl-2蛋白的影響;
　　3.利用Western Blot檢測FZY-80對SHH蛋白以及GLI1蛋白的影響。
　　結(jié)果:
　　1.低劑量的FZY-80能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并阻滯細(xì)胞周期于G2/M期;隨著FZY-80濃度的提高，肺癌細(xì)胞株A549的細(xì)胞早期凋亡率和總凋亡率（早期+晚期凋亡率

8、）顯著升高(P＜0.05);
　　2.Western Blot實驗結(jié)果顯示隨著FZY-80濃度的增加，肺癌細(xì)胞A549中P21蛋白表達(dá)量顯著增加(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。FZY-80對P21蛋白具有上調(diào)作用，對Bcl-2蛋白具有下調(diào)作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性;
　　3.Western Blot實驗結(jié)果顯示隨著FZY-80濃度的增加，肺癌細(xì)胞A549中SHH蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，

9、GLI1蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。FZY-80對SHH和GLI1蛋白表達(dá)具有抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　第三部分 新型核苷化合物FZY-80對KM小鼠的急性毒性研究
　　方法:
　　采用KM小鼠，單次灌胃:100-2000mg/kg的化合物FZY-80，觀察給藥后動物狀態(tài)、異常反應(yīng)和死亡數(shù)量。采用Bliss法計算半數(shù)致死量(LD50)，觀察其急性毒性癥狀，記錄累計死亡數(shù)及小鼠體重變化。
　　結(jié)果:

10、
　　1.給藥后對照組與100mg·kg-1FZY-80組小鼠的一般狀態(tài)觀察呈正常表現(xiàn)，F(xiàn)ZY-80其余各劑量組小鼠均呈現(xiàn)活動減少，食欲減退，被毛松亂等明顯毒性反應(yīng)，該毒性反應(yīng)在給藥第10天左右開始緩解。
　　2.給藥后對照組與100mg·kg-1FZY-80組小鼠體重增加明顯，F(xiàn)ZY-80其余劑量組小鼠體重顯著降低(P＜0.05)，但自第10天體重開始回升。
　　3.使用LD50法進(jìn)行化合物FZY-80的經(jīng)口灌胃急性

11、毒性實驗，小鼠經(jīng)口灌胃化合物FZY-80的LD50為1053.78mg/kg，LD50的95％可信區(qū)間1000.50-2467.67mg/kg。
　　第四部分 新型核苷化合物FZY-80對SD大鼠的長期毒性研究
　　方法:
　　1.動物分組和給藥:取健康SD大鼠160只，按體重隨機(jī)分為溶媒對照組(C組，生理鹽水)、供試品低劑量組（L組，20mg·kg-1·d-1）、中劑量組（M組，40mg·kg-1·d-1）、高劑量組

12、（H組，80mg·kg-1·d-1），每組40只，雌雄各半。每周給藥6天，連續(xù)給藥3個月（12周）。停藥后留取部分動物繼續(xù)觀察1個月(4周)，了解毒性反應(yīng)可逆程度及出現(xiàn)的延遲性毒性反應(yīng)。
　　2.測定指標(biāo)和時間:每天進(jìn)行一般狀況觀察，每周稱體重2次、并于給藥6周、12周和恢復(fù)期觀察結(jié)束時，進(jìn)行血液學(xué)、血液生化學(xué)以及病理學(xué)檢查（包括呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)）。
　　結(jié)果

13、:
　　1.一般狀況:在給藥期間及恢復(fù)期內(nèi)，除L組3只大鼠，M組1只大鼠因灌胃操作不當(dāng)死亡外，其余各用藥組大鼠的一般狀況良好，并未觀察到明顯的藥物相關(guān)毒性癥狀，與C組比較無顯著差異。
　　2.體重:在各期間，各用藥組大鼠的體重與C組比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.血液學(xué)檢查:給藥6周、12周時各給藥組大鼠的-白細(xì)胞與C組相比顯著下降(P＜0.05)，其余各項檢測指標(biāo)L、M、H組與同期C組相比無顯著性差異(P

14、＞0.05)?；謴?fù)期觀察結(jié)束時，各給藥組大鼠的各項血液學(xué)指標(biāo)與C組相比均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　4.血液生化學(xué)檢查:給藥6周、12周時，各給藥組大鼠的天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、尿素氮、肌酐、總蛋白與C組相比顯著升高(P＜0.05)，其余各項檢測指標(biāo)L、M、H組與同期C組相比均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　5.病理學(xué)檢查:①給藥6周，H組大鼠肝細(xì)胞胞漿疏松，有多量大小不一的空泡，肝竇中見數(shù)量

15、不等的庫弗氏細(xì)胞。其余各臟器未見明顯病理學(xué)改變。②給藥12周:M組和H組大鼠均出現(xiàn)上述肝臟病理學(xué)改變;H組大鼠出現(xiàn)灶性間質(zhì)性腎炎，皮髓交界處腎小管上皮細(xì)胞水腫。其余各臟器未見明顯病理學(xué)改變。③恢復(fù)期觀察結(jié)束:各臟器未見明顯病理學(xué)改變。
　　第五部分 新型核苷化合物FZY-80藥代動力學(xué)研究
　　方法:
　　采用SD大鼠進(jìn)行藥代動力學(xué)實驗，大鼠分別灌胃和靜脈注射化合物FZY-80(20mg·kg-1)。于給藥前和給藥后0

16、、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24h自眼底靜脈叢取血，用EDTA-K2抗凝，分離血漿。血漿化合物FZY-80濃度采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法(LC-MS/MS)進(jìn)行分析。采用DAS3.0軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)，求得絕對生物利用度。
　　結(jié)果:
　　1、SD大鼠灌胃化合物FZY-80(20mg·kg-1)后達(dá)峰時間(Tmax)為2.00±0.38h，表明吸收較快，達(dá)峰濃度為714.20±168.39ng·kg-1

17、。消除半衰期(t1/2為5.05±1.12h，表明在體內(nèi)保留時間適中，有利于發(fā)揮藥理作用。
　　2、藥代動力學(xué)實驗顯示SD大鼠灌胃和靜脈注射化合物FZY-80(20mg·kg-1)后AUC0-t分別為4805.99±956.04ng·kg-1·d-1q和7530.00±1360.01ng·kg-1·d-1，AUC0-∞分別為4986.52±997.30ng·kg-1·d-1和7655.99±1378.08ng·kg-1·d-1，求