優(yōu)化設(shè)計(jì)并人工合成的納豆激酶基因在甜瓜和番茄中的高效表達(dá).pdf

1、納豆激酶(nattokinase，NK)是由納豆枯草桿菌(Bacillus subtilis var.natto)分泌的一種堿性蛋白酶，其活性發(fā)揮依賴直接和間接兩種途徑，具有很強(qiáng)的溶解血栓纖維蛋白的活性。其安全、可口服、方便有效等優(yōu)點(diǎn)，使得它作為一種新型的口服溶栓劑，在預(yù)防和治療心血管疾病方面具有很好的應(yīng)用前景。
　　本論文克隆了納豆枯草桿菌來(lái)源的納豆激酶基因aprN(eNK)，根據(jù)植物密碼子的使用頻率，以不改變NK氨基酸序列為前

2、提，重新優(yōu)化設(shè)計(jì)該基因，獲得了人工合成的納豆激酶基因sNK。利用重疊延伸PCR技術(shù)，在上述兩種基因中插入番茄果實(shí)特異性表達(dá)基因E8的第一內(nèi)含子構(gòu)成eNKi和sNKi基因。在上述四種基因的起始密碼子ATG前插入Kozak序列，以植物雙元表達(dá)載體pPZP221(35 S-nos)為構(gòu)建的初始載體，將這四種納豆激酶基因——eNK、eNKi、sNK和sNKi分別克隆到組成型表達(dá)的CaMV35S啟動(dòng)子和果實(shí)特異性表達(dá)的E8啟動(dòng)子下游，構(gòu)建8種植物

3、表達(dá)載體:p35S-eNK、pE8-eNK、p35S-eNKi、pE8-eNKi、p35S-sNK、pE8-sNK、p35S-sNKi和pE8-sNKi，凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。
　　通過(guò)農(nóng)桿菌滲透法將四種納豆激酶基因注射到甜瓜品種河套蜜瓜(Cucumismelo L.cv Hetao)果實(shí)中并實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò)正交試驗(yàn)摸索得到在甜瓜果實(shí)中瞬時(shí)表達(dá)納豆激酶基因的最優(yōu)條件:乙酰丁香酮濃度為250μmol/L、農(nóng)桿菌濃度OD6

4、00=0.6及注射后5天采收果實(shí)，納豆激酶的表達(dá)量最高。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RT-qPCR)比較四種基因在不同成熟時(shí)期的甜瓜果實(shí)中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量;通過(guò)纖維蛋白平板法檢測(cè)四種基因表達(dá)產(chǎn)物的纖溶酶活性。RT-qPCR結(jié)果表明，經(jīng)密碼子優(yōu)化的sNK和sNKi基因的表達(dá)量顯著高于未改造的eNK和eNKi基因的表達(dá)量，其中35S啟動(dòng)子調(diào)控下的sNK基因平均表達(dá)量為eNK基因的8.64倍，而E8啟動(dòng)子調(diào)控下的sNKi基因則為eNKi基因平均

5、表達(dá)量的10.93倍。E8啟動(dòng)子調(diào)控下的sNK和sNKi基因的表達(dá)量較組成型35S啟動(dòng)子調(diào)控下的該基因的表達(dá)量明顯提高，在果實(shí)成熟中期表達(dá)量達(dá)到最高。內(nèi)含子在sNKi基因的轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程中能夠被正確的剪切掉，sNKi基因和sNK基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相同，但sNKi基因的表達(dá)量高于無(wú)內(nèi)含子的sNK基因，表明內(nèi)含子對(duì)納豆激酶基因的瞬時(shí)表達(dá)具有顯著的促進(jìn)作用。纖溶酶活性測(cè)定結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果基本一致，纖維蛋白平板法在sNK和sNKi基因的瞬時(shí)

6、表達(dá)樣品中均能檢測(cè)到纖溶酶活性，表明目的基因在甜瓜果實(shí)中可正常翻譯并表現(xiàn)出溶栓活性，且E8啟動(dòng)子調(diào)控下的sNKi基因表達(dá)產(chǎn)物的纖溶酶活性最高，可達(dá)237.90 U/g。
　　將sNK和sNKi基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化Moneymaker和Micro-Tom番茄(Lycopersiconesculentum Mill)果實(shí)，其納豆激酶基因的表達(dá)情況和甜瓜中類似。sNK和sNKi基因在番茄果實(shí)的轉(zhuǎn)色期、成熟期和完熟期都能表達(dá)，其中成熟期表達(dá)量最高

7、，破色期基本無(wú)表達(dá)。在E8啟動(dòng)子的調(diào)控下，sNKi基因表達(dá)的最高纖溶酶活可達(dá)144.27 U/g。
　　通過(guò)農(nóng)桿菌侵染的方法將sNK和sNKi基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到Moneymaker、M82和Micro-Tom三種番茄中。T0代轉(zhuǎn)基因番茄經(jīng)PCR檢測(cè)，分別得到轉(zhuǎn)p35S-sNK番茄32株，轉(zhuǎn)pE8-sNK番茄27株，轉(zhuǎn)p35S-sNKi番茄21株和轉(zhuǎn)pE8-sNKi番茄27株，初步證明目的基因已整合到番茄基因組中。經(jīng)加代培養(yǎng)得到T1代轉(zhuǎn)

8、基因番茄植株，在轉(zhuǎn)p35S-sNK番茄中，有11株檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，7株檢測(cè)到纖溶酶活性;在轉(zhuǎn)pE8-sNK番茄中，有12株檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，8株檢測(cè)到纖溶酶活性;在轉(zhuǎn)p35S-sNKi番茄中，有8株檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，6株檢測(cè)到纖溶酶活性;在轉(zhuǎn)pE8-sNKi番茄中，有11株檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，10株檢測(cè)到纖溶酶活性。其中，Moneymaker番茄的AD1-3植株表達(dá)產(chǎn)物的纖溶酶活性最高，為30.69 U/g。將表達(dá)出纖溶