靶向聚合物膠束用于小分子藥物的腦內(nèi)遞送.pdf

1、腦部以及神經(jīng)系統(tǒng)的重大疾?。ㄈ缒X腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和神經(jīng)退行性疾病等）的發(fā)病率和死亡率逐年呈上升趨勢[1，2]。但由于血腦屏障(Blood-BrainBarrier,BBB)的存在，98％以上的小分子藥物和100％的大分子藥物難以入腦，使得腦部疾病的治療成為急需人類攻克的重大難題。
　　目前，臨床上對于腦部感染或腦腫瘤的治療藥物，通常是小分子藥物，但藥物在臨床使用過程中面臨很多嚴峻的考驗:
　　(1)藥物自身性質(zhì)的影響，

2、很多抗感染或抗腫瘤的藥物是難溶性小分子藥物，這為臨床給藥，尤其是靜脈給藥帶來困難;
　　(2)藥物在病灶部位的蓄積能力差，藥物隨血液循環(huán)全身分布，不僅造成病灶部位難以達到治療濃度，發(fā)揮藥效，而且因藥物在其他器官的蓄積而造成嚴重的毒副作用;
　　(3)產(chǎn)生耐藥性，無論是造成感染的病原體還是引發(fā)腫瘤的腫瘤細胞，在進行連續(xù)多次給藥后，易產(chǎn)生耐藥性而使治療無效。
　　針對上述問題，為提高腦部重大疾病的藥物治療效果，本課題通過藥

3、劑學、高分子學和生物學手段的交叉應用，采用目前廣泛研究的納米載體—聚合物膠束，對難溶性小分子藥物的腦內(nèi)遞送進行系統(tǒng)性地研究。
　　首先，這是由于聚合物膠束用于腦靶向遞送小分子藥物顯示出更大的優(yōu)勢:
　　(1)通過將疏水性藥物包載于內(nèi)核，大大增加其溶解度;
　　(2)膠束自身較小的粒徑（十幾納米）優(yōu)勢，更加易于透過BBB;
　　(3)可進行表面靶向功能性分子的修飾;
　　(4)膠束將藥物包載于內(nèi)核中，可以避開

4、P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)對藥物分子的識別，進而減少藥物外排作用，降低耐藥性。
　　然而，傳統(tǒng)的靶向聚合物膠束在具有上述優(yōu)勢的同時，在實際運用中，仍存在很多缺陷:
　　(1)目前靶向分子的選取多采用多肽、單抗等，多采用受體介導的靶向策略，而使其靶向能力提高程度有限;
　　(2)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，聚合物材料的選取多為傳統(tǒng)兩親性嵌段聚合物，因存在臨界膠束濃度(Critical MicelleConce

5、ntration，CMC)的問題，在血液大量稀釋情況下，膠束易散開進而發(fā)生藥物泄露。二者共同作用導致的結(jié)果是，靶向遞送藥物的效率大大降低。
　　因此，為改進上述問題，本課題創(chuàng)新性地設(shè)計得到一種靶向智能型聚合物膠束，其優(yōu)勢體現(xiàn)于:
　　(1)利用轉(zhuǎn)運體介導策略，開發(fā)高效靶向分子。本課題設(shè)計得到一種高親和力的靶向分子，氧化型抗壞血酸(dehydroascorbic acid，DHA)，可特異性識別BBB以及腫瘤細胞表面高表達的葡

6、萄糖轉(zhuǎn)運體1(facilitative glucose transporter1，GLUT1)。將其修飾于聚合物膠束表面，可實現(xiàn)腦組織與腫瘤組織的雙重靶向;
　　(2)開發(fā)一種安全性以及生物相容性高的聚氨基酸類高分子材料，利用其側(cè)鏈的活性基團，采用細胞微環(huán)境敏感的交聯(lián)劑與其發(fā)生交聯(lián)反應，得到細胞微環(huán)境觸發(fā)藥物釋放的智能型聚合物膠束。因此，在二者共同作用下，本課題設(shè)計的靶向智能型聚合物膠束具有的特點是:
　　(1)血液循環(huán)中高

7、度穩(wěn)定，避免藥物泄露，減少藥物被酶降解;
　　(2)腦組織或腦膠質(zhì)瘤的靶向，實現(xiàn)靶部位甚至靶細胞的藥物遞送，進而大大提高聚合物膠束的靶向效率。
　　第Ⅰ部分多肽修飾的傳統(tǒng)腦靶向聚合物膠束
　　本文第Ⅰ部分（第一、二章）的研究，采用美國FDA認證的脂質(zhì)類材料PEG-PE作為載體材料，制備傳統(tǒng)的聚合物膠束。利用BBB上高表達低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（low-density lipoprotein receptor-rela

8、ted protein，LRP）的特性，在膠束表面修飾LRP受體的配體，Angiopep-2，實現(xiàn)受體介導的腦靶向聚合物膠束的跨BBB轉(zhuǎn)運[8]。
　　本文第一章主要以Angiopep-2作為腦靶向頭基，以疏水性的抗真菌藥物兩性霉素B（amphotericin B，AmB）作為模型藥物，PEG-PE作為載體材料，構(gòu)建載AmB的腦靶向聚合物膠束給藥系統(tǒng)，Angiopep-PEG-PE/AmB。采用薄膜水化法制備PEG-PE/AmB聚

9、合物膠束，并通過星點設(shè)計-效應面優(yōu)化法進行處方優(yōu)化，得到最優(yōu)的載藥聚合物膠束制備工藝。表征結(jié)果顯示，優(yōu)化后的處方包封率和載藥量分別為83％和12％，粒徑穩(wěn)定控制在10-15 nm。分別于體外單層腦毛細血管內(nèi)皮細胞（brain capillary endothelial cells，BCECs）和體內(nèi)考察Angiopep-2修飾的聚合物膠束的性質(zhì)，結(jié)果證實，Angiopep-2修飾后，可顯著提高聚合物膠束在BCECs上的攝取效率，而且體內(nèi)

10、促進AmB向腦內(nèi)積累，顯著提高腦靶向性。另外，該將AmB包載進入膠束內(nèi)核后，可顯著降低AmB細胞毒性和在外周組織的蓄積，因此可以提高靜脈用藥的安全性。本章研究對Angiopep-PEG-PE/AmB潛在的腦轉(zhuǎn)運機制進行深入探討，結(jié)果表明，Angiopep-PEG-PE聚合物膠束保留了Angiopep-2的配體-受體結(jié)合性質(zhì)，通過受體介導的跨細胞轉(zhuǎn)運過程跨越BBB。而且，Angiopep-PEG-PE可以保護藥物分子避開P-gp的識別，從

11、而克服P-gp對藥物的外排作用，延長藥物在腦內(nèi)的滯留時間。經(jīng)腦切片共聚焦實驗證實，Angiopep-2的修飾不僅可促進聚合物膠束跨越BBB，并能夠進一步被腦實質(zhì)細胞攝取。
　　本文第二章主要將構(gòu)建好的Angiopep-PEG-PE/AmB聚合物膠束，用于CNS感染的治療。在本章的第一節(jié)詳細介紹了免疫缺陷的CNS感染小鼠模型建立方法，并對其進行病理學表征，證實模型建立成功。在模型鼠上，以市售AmB制劑作為對照，分別采用Angiope

12、p-PEG-PE/AmB和PEG-PE/AmB聚合物膠束進行治療，實驗結(jié)果顯示，Angiopep-2修飾后能夠有效增加聚合物膠束在模型小鼠腦內(nèi)的分布，進而能夠有效降低模型鼠腦內(nèi)菌量，控制真菌向腦實質(zhì)區(qū)域侵蝕，延長小鼠存活時間，降低AmB腎毒性。考慮到AmB引起的腎毒性具有劑量依賴性，Angiopep-PEG-PE/AmB聚合物膠束表現(xiàn)出的最大的優(yōu)勢是，以較低的劑量能夠?qū)崿F(xiàn)同等或更高的治療效果。因此，該腦靶向聚合物膠束給藥系統(tǒng)對AmB的腦

13、內(nèi)遞送具有潛在的臨床應用價值。
　　第Ⅱ部分小分子修飾的細胞微環(huán)境響應的智能型聚合物膠束
　　在前期對傳統(tǒng)聚合物膠束的研究以及通過大量文獻查閱與整理的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的靶向聚合物膠束的設(shè)計思路是:
　　(1)采用傳統(tǒng)的兩親性聚合物材料，例如脂質(zhì)類、PEG-PLGA或普朗尼克系列等;
　　(2)靶向分子多采用多肽、單抗等，通過受體介導的途徑進行靶向遞送。
　　然而，傳統(tǒng)的聚合物膠束在實際應用中面臨很多問題，例

14、如，其在血液中抗稀釋能力差[40-46]，易于發(fā)生藥物泄露，使藥物被快速代謝或降解;靶向能力提高程度非常有限等。針對上述問題，在第二部分的研究中，我們主要提出2個策略:
　　策略1:開發(fā)高效、高親和力的靶向分子;
　　策略2:聚合物材料本身進行共價交聯(lián)，內(nèi)核形成抗藥物泄露的“智能屏障”。
　　首先，為實現(xiàn)策略1，我們設(shè)計并合成得到一種小分子化合物，氧化型抗壞血酸(dehydroascorbic acid，DHA)。DH

15、A是BBB上以及大多數(shù)惡性腫瘤細胞表面高表達的葡萄糖轉(zhuǎn)運體1（facilitative glucose transporter1，GLUT1）的底物，能夠特異性識別GLUT1，并通過GLUT1進行轉(zhuǎn)運[34-38]。本文第三章介紹了2位炔丙基取代的DHA的合成路線以及對化合物結(jié)構(gòu)的表征，并在體外BCECs和體內(nèi)對其腦靶向性進行研究，實驗結(jié)果證實，合成得到的DHA通過Na+非依賴型的GLUT1向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，與文獻報道一致，并證實DHA在體

16、內(nèi)能夠跨越BBB向腦組織蓄積。
　　其次，為實現(xiàn)策略2，本文第四章設(shè)計合成得到一種兩親性三嵌段的聚氨基酸類高分子材料，聚乙二醇-聚賴氨酸-聚苯丙氨酸（PEG-pLys-pPhe）。其中，PEG鏈提供親水端，一方面，可形成聚合物膠束的外殼，延長膠束體內(nèi)循環(huán)時間;另一方面，PEG的外端可以進行疊氮功能化，與炔丙基化的DHA通過Click反應進行連接。聚賴氨酸嵌段(pLys)，由于其側(cè)鏈具有活性的伯胺基團，可以與含有與伯胺反應基團的交聯(lián)

17、劑發(fā)生反應，從而形成環(huán)境敏感的交聯(lián)聚合物膠束。聚苯丙氨酸嵌段(pPhe)，提供疏水內(nèi)核，用于包載疏水性藥物。聚氨基酸類高分子材料作為一種可生物降解的高分子材料，具有易被機體吸收、代謝、生物相容性好等特點。
　　我們將策略1與策略2進行結(jié)合（如Fig.1-1所示），本文第五章選取DHA作為腦靶向分子，通過在處方中調(diào)整DHA-PEG-pLys-pPhe與PEG-pLys-pPhe的比例，采用透析法得到不同修飾度的DHA-PLysP聚合

18、物膠束，進一步進行二硫鍵交聯(lián)后，即得到DHA-PLys(s-s)P聚合物膠束。該聚合物膠束內(nèi)核中形成具有抗藥物泄露的“智能屏障”，它可以有效防止藥物在體循環(huán)中泄露，然而當進入靶細胞后，在胞漿高濃度GSH作用下，二硫鍵屏障消失，藥物釋放出來發(fā)揮作用。實驗證實，該聚合物膠束具有高度的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并在體外表現(xiàn)出胞漿內(nèi)谷胱甘肽(glutathione，GSH)敏感的藥物釋放特性。體外細胞攝取實驗表明，DHA-PLys(s-s)P在BCECs上的

19、攝取效率遠高于未修飾組。體內(nèi)分布實驗結(jié)果提示，DHA能夠促進聚合物膠束跨越BBB，并進一步被腦實質(zhì)細胞攝取。綜合上述結(jié)果，說明將DHA修飾于聚合物膠束表面后，DHA仍保持著高效的GLUT1識別和結(jié)合能力，而且DHA-PLys(s-s)P可以高效地遞送藥物跨越BBB，進入腦實質(zhì)細胞再釋放藥物。由于其在體循環(huán)中穩(wěn)定性增加，可以有助于提高藥物的遞送效率。
　　經(jīng)過第三、四、五章的研究，我們成功構(gòu)建了DHA修飾的智能型聚合物膠束，其表現(xiàn)出

20、高效的跨越BBB向腦內(nèi)蓄積的能力。本文第六章主要采用疏水性抗真菌藥物伊曲康唑(itraconazole，ITZ)作為模型藥物，用DHA修飾的聚合物膠束包載ITZ，得到DHA-P Lys(s-s)P/ITZ，并對其體內(nèi)藥動學行為和組織分布進行考察，結(jié)果顯示，DHA可以存進聚合物膠束入腦;另外，由于該聚合物膠束在體循環(huán)中非常穩(wěn)定，可以有效降低ITZ被酶代謝成HO-ITZ，并進一步代謝成沒有活性的成分。在二者共同作用下，可有效提高腦內(nèi)的藥物濃

21、度。在模型鼠上評價DHA-PLys(s-s)P/ITZ聚合物膠束的抗CNS感染的治療效果，結(jié)果顯示，DHA修飾的載ITZ智能型聚合物膠束能夠有效治療CNS感染，并顯著延長感染小鼠的存活時間。
　　據(jù)文獻報道，腫瘤細胞區(qū)別于正常細胞的重要特征之一，就是高水平的葡萄糖攝取和糖代謝[74]。研究證實，惡性腫瘤細胞的葡萄糖需求量遠高于正常細胞，葡萄糖分子是腫瘤細胞重要的能量來源[75]。因此，GLUT1成為腫瘤細胞轉(zhuǎn)運和代謝葡萄糖的重要通

22、路，其在大部分的腫瘤細胞表面過表達[76]。前期實驗已經(jīng)證實，DHA由于能特異性識別BBB上表達的GLUT1，而促進聚合物膠束向腦內(nèi)積累。本文第七章研究，我們嘗試采用構(gòu)建的DHA-PLys(s-s)P聚合物膠束，遞送疏水性的抗腫瘤藥物紫杉醇(paclitaxel，PTX)用于腦膠質(zhì)瘤的治療，分別在細胞水平和動物水平全面地評價其腫瘤靶向性與抗腫瘤活性。體內(nèi)外結(jié)果證實，DHA修飾的聚合物膠束能夠促進PTX在腫瘤邊緣甚至腫瘤中心區(qū)域蓄積并進入