C5a反義肽對(duì)膿毒癥心肌損傷的影響及潛在的機(jī)制研究.pdf

1、嚴(yán)重膿毒癥(severe sepsis)和膿毒癥休克是危重病病人死亡的首要原因。盡管采取了改善外科療法、抗生素治療和免疫調(diào)節(jié)等手段,膿毒癥仍然是導(dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)病人最常見(jiàn)死因。膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染發(fā)生免疫和炎癥應(yīng)答的表現(xiàn)。嚴(yán)重膿毒癥定義為膿毒癥伴有臟器功能衰竭,而膿毒癥休克定義為膿毒癥給予充分液體復(fù)蘇后仍伴有頑固性低血壓；其中,膿毒癥的心肌損害參與了膿毒癥休克的發(fā)生與發(fā)展。晚近文獻(xiàn)報(bào)道,嚴(yán)重膿毒癥的年發(fā)病率為每100000人口中132人,死亡

2、率達(dá)50％。美國(guó)的臨床觀(guān)察發(fā)現(xiàn),膿毒癥病人普遍存在心肌收縮力下降；75％的膿毒癥患者存在心血管功能衰竭,表現(xiàn)為嚴(yán)重、持續(xù)、甚至有時(shí)是頑固性低血壓。在過(guò)去10年中,臨床觀(guān)察及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)膿毒癥休克病人的心血管功能衰竭與膿毒癥的心肌損害有關(guān)。細(xì)菌或內(nèi)毒素(LPS)啟動(dòng)了一系列炎癥反應(yīng),導(dǎo)致心肌收縮力降低、左心室擴(kuò)大、射血分?jǐn)?shù)下降、對(duì)容量負(fù)荷收縮反應(yīng)差、收縮峰值壓力/收縮末期容積比值下降等。這種膿毒癥和其他全身炎癥過(guò)程所引起的心肌抑制和細(xì)胞損

3、傷,極大的增加氧耗,抑制微循環(huán),減少心肌氧輸送,最終導(dǎo)致心肌損傷和肌鈣蛋白釋放入血循環(huán)。心肌抑制與損傷的原因目前尚不明確,因此,探討其發(fā)生機(jī)制,尋求防治膿毒癥心功能障礙的發(fā)生和發(fā)展的有效手段,對(duì)膿毒癥的救治有重要的臨床意義。
　　 目前認(rèn)為細(xì)胞因子的產(chǎn)生和炎癥介質(zhì)的釋放可能在膿毒癥心肌損傷起一定作用,包括腫瘤壞死因子(TNF)、IL-1、IL-6等:白細(xì)胞衍生的超氧化物及其分子及Caspase的激活,均可能參與心肌損傷的發(fā)病。實(shí)

4、驗(yàn)研究顯示,膿毒癥時(shí)微血管灌注和心肌氧攝取受損具有不均一性,其潛在的細(xì)胞機(jī)制包括中性粒細(xì)胞激活與內(nèi)皮的粘附、以及其釋放活性自由基和氧化產(chǎn)物等對(duì)血管內(nèi)皮和心肌細(xì)胞損傷,導(dǎo)致其功能障礙。同時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞活化產(chǎn)生的NO、內(nèi)皮素以及前列腺素等增多,抑制心肌小梁等長(zhǎng)收縮；并促進(jìn)中性粒細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移并活化循環(huán)中性粒細(xì)胞進(jìn)入心肌間質(zhì)；而激活的中性粒細(xì)胞所致血管內(nèi)皮和心肌細(xì)胞炎癥損傷,增加血管滲漏。因此,中性粒細(xì)胞的粘附遷移級(jí)聯(lián)過(guò)程在膿毒癥心肌抑制的發(fā)生

5、發(fā)展中起著重要作用。MPO是中性粒細(xì)胞的特異性酶,能催化產(chǎn)生多種活性氧化物質(zhì),導(dǎo)致氧化應(yīng)激和氧化性組織損傷,其激活程度與中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度密切相關(guān),其活性的測(cè)定可以反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況。
　　 P-選擇素是一種高糖基化的單鏈跨膜糖蛋白,是細(xì)胞粘附分子選擇素家族成員,分子量140KD,主要存在于靜息血小板的α顆粒及內(nèi)皮細(xì)胞的Weibel-Palade小體中,通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞起始粘附、啟動(dòng)參與了包括白細(xì)胞的粘附遷移級(jí)聯(lián)過(guò)程,在炎癥、

6、血栓形成中起著重要作用；同時(shí),P-選擇素是影響中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間粘附的重要因子之一。靜止?fàn)顟B(tài)下,血小板或內(nèi)皮細(xì)胞表面不表達(dá)P-選擇素,在各種刺激因素刺激下,血小板的α顆粒和內(nèi)皮細(xì)胞的Weibel-palade小體膜與細(xì)胞膜迅速融合,導(dǎo)致P-選擇素于數(shù)分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面,通過(guò)與中性粒細(xì)胞表面的P-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)相互作用,促進(jìn)血小板或內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的粘附,介導(dǎo)中性粒細(xì)胞在內(nèi)皮上滾動(dòng)、遷移、聚集和活化。在膿毒

7、癥中,P-選擇素的主要作用包括介導(dǎo)活化的血小板和單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的連接,以及內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的快速粘附、啟動(dòng)炎癥反應(yīng):與L-選擇素、E-選擇素共同介導(dǎo)白細(xì)胞浸潤(rùn),引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和組織損傷。
　　 作為多種補(bǔ)體激活途徑的共同產(chǎn)物C5a與膿毒癥免疫麻痹、多器官功能衰竭及淋巴細(xì)胞凋亡密切相關(guān),在膿毒癥的病理生理過(guò)程中,通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)、參與凝血、促進(jìn)PMN聚集、抑制PMN先天免疫、誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡等方面起重要作用；C

8、5a作為心肌抑制因子之一對(duì)心肌具有直接抑制作用。拮抗C5a已被膿毒癥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所證實(shí)；本課題組前期自主篩選合成了一種新型C5a拮抗多肽(C5a反義肽),相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明了其能拮抗C5a的生物學(xué)活性,并可改善小鼠膿毒癥模型的炎癥反應(yīng)。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抗C5a抗體可逆轉(zhuǎn)膿毒癥導(dǎo)致的左心室壓力及心肌收縮力的減低,但其具體機(jī)制目前尚不明確。在相關(guān)的研究顯示,內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素的表達(dá)隨著C5a濃度的增加而增加,中性粒細(xì)胞粘附率也表現(xiàn)類(lèi)似的趨勢(shì)；而阻斷C

9、5a可使肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度顯著減輕。但P-選擇素表達(dá)對(duì)膿毒癥中性粒細(xì)胞在心肌組織中的扣押與損傷有待進(jìn)一步研究；同時(shí),新合成的C5a反義肽能否在體內(nèi)拮抗C5a引起內(nèi)皮細(xì)胞的P-選擇素過(guò)表達(dá)及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),從而改善心肌損傷也有待驗(yàn)證。
　　 目的
　　 探討膿毒癥時(shí)心肌組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)與心肌損傷的關(guān)系；研究心肌組織P-選擇素表達(dá)情況與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)/扣壓及心肌損傷的關(guān)系；驗(yàn)證靜脈注射C5a反義肽對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用

10、及可能的機(jī)制,為膿毒癥早期心肌損傷提供新的治療靶點(diǎn)。
　　 方法
　　 1)采用盲腸結(jié)扎穿孔法建立小鼠膿毒癥模型,分正常組、假手術(shù)組、膿毒癥組、反義肽干預(yù)組,在不同時(shí)間點(diǎn)(2h、4h、8h、12h)用ELISA方法,檢測(cè)血清肌鈣蛋白Ⅰ濃度,采用MPO試劑盒檢測(cè)心肌組織MPO活性,比較各時(shí)間點(diǎn)各組血清肌鈣蛋白Ⅰ濃度和心肌組織MPO活性,了解膿毒癥心肌損傷與心肌組織中性粒細(xì)胞聚集的關(guān)系,觀(guān)察靜脈注射C5a反義肽對(duì)心肌損傷及心

11、肌組織中性粒細(xì)胞聚集的影響；
　　 2)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡方法檢測(cè)心肌組織P-選擇素基因和蛋白水平的變化情況,了解膿毒癥時(shí)心肌組織P-選擇素表達(dá)水平及與時(shí)間的關(guān)系,研究其與心肌損傷和心肌組織中性粒細(xì)胞聚集的關(guān)系,比較各組P-選擇素表達(dá)水平,探討靜脈注射C5a反義肽對(duì)P-選擇素表達(dá)水平的影響。
　　 結(jié)果
　　 1)C5a反義肽對(duì)心肌損傷及心肌組織中性粒細(xì)胞聚集的影響
　　 正常小鼠心肌組織M

12、PO含量為0.611±0.061U/g。假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)心肌組織MPO活性與正常組類(lèi)似(P>0.05)。造模組2h、4h、8h、12h測(cè)得的心肌組織MPO含量分別為1.260±0.068 U/g、1.520±0.105 U/g、1.696±0.041 U/g、1.758±0.136 U/g；反義肽干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的心肌組織MPO含量分別為1.067±0.095 U/g、1.327±0.093 U/g、1.331±0.053 U/g、1

13、.421±0.185 U/g。與假手術(shù)組相比,造模組和反義肽干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)心肌組織MPO含量有顯著升高(P<0.05)；和造模組相比,反義肽干預(yù)組心肌組織MPO含量有顯著下降(P<0.05)。假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)cTnI的濃度與正常組類(lèi)似(P>0.05)。造模組2h、4h、8h、12h測(cè)得的cTnI濃度分別為0.017±0.009 ng/ml、0.106±0.008 ng/ml、0.528±0.066 ng/ml、2.959±0.170 n

14、g/ml。反義肽干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)cTnI濃度為0.017±0.005 ng/ml、0.062±0.006 ng/ml、O.124±0.008 ng/ml、1.469±0.191 ng/ml。與假手術(shù)組相比,在造模后2小時(shí)造模組、反義肽干預(yù)組cTnI濃度均無(wú)顯著升高(P>0.05)；造模4小時(shí)后造模組和反義肽干預(yù)組cTnI濃度較假手術(shù)組均有顯著升高(P<0.05),且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),cTnI濃度呈上升趨勢(shì)；和造模組相比,反義肽干預(yù)組cTnI

15、濃度有顯著下降(P<0.05)。
　　 2)C5a反義肽治療膿毒癥小鼠心肌損傷與P-選擇素的相關(guān)性
　　 正常組和假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)P-選擇素mRNA表達(dá)量無(wú)顯著性差異；而造模組和反義肽干預(yù)組P-選擇素mRNA表達(dá)量隨著時(shí)間的增加而顯著增加。在2、4、8、12各時(shí)間點(diǎn),假手術(shù)組P-選擇素mRNA表達(dá)量分別為:0.726±0.307、0.841±0.443、1.558±0.658、1.162±0.172,和正常組比較無(wú)顯著性

16、差異(P>0.05),造模組各時(shí)間點(diǎn)P-選擇素mRNA表達(dá)量分別為:5.311±0.990、9.799±0.719、104.336±13.511、192.267±16.611,反義肽干預(yù)組P-選擇素mRNA表達(dá)量分別為:2.76±0.199、4.889±0.772、52.877±8.900、87.878±3.475,與正常組和假手術(shù)組比均有顯著性增高(P>0.05)；與造模組相比,在4、8、12h時(shí)間點(diǎn),反義肽干預(yù)組P-選擇素mRNA表

17、達(dá)量有顯著下降(P<0.05)。
　　 正常組和假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)P-選擇素蛋白表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)；造模組2h、4h、8h、12h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組的P-選擇素蛋白相對(duì)定量分別為0.399±0.019、0.643±0.023、0.681±0.024和0.69±0.021；與正常及假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；反義肽干預(yù)組2h、4h、8h、12h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)P-選擇素蛋白相對(duì)定量分別為0.29±0.031、

18、0.43±0.010、0.456±0.013和0.480±0.017；顯著低于造模組(P<0.05),但與對(duì)照組相比,仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。
　　 3)心肌組織P-選擇素mRNA表達(dá)與心肌組織MPO活性,顯著正相關(guān),(r=0.728,P=0.000)；心肌組織P-選擇素蛋白表達(dá)與心肌組織MPO活性呈顯著正相關(guān),(r=0.961,P=0.000)
　　 結(jié)論
　　 1)膿毒癥早期即己出現(xiàn)心肌損傷,且心肌