不同結(jié)構納米纖維支架對骨髓間充質(zhì)干細胞行為的影響及其機制研究.pdf

1、為了研究能應用于椎間盤突出臨床實踐的組織工程仿生材料，本課題組前期對聚乳酸/聚已內(nèi)酯(Poly(L-Lactide)/Polycaprolactone，PLLA/PCL）材料進行了研究，結(jié)果顯示這種材料具有優(yōu)良的力學性能、有效的表面活性與降解速率可調(diào)控性等優(yōu)勢。為了繼續(xù)深入研究和優(yōu)化支架材料，使之向臨床應用進一步推進，我們對PLLA/PCL材料配置比例及制作方法進行了改進，制備了的三種不同結(jié)構的納米纖維材料進行了比較研究，優(yōu)化了細胞長入

2、條件，并探索了不同結(jié)構材料促進組織再生的可能機制。
　　本研究中，我們首先制備了納米紗(Aligned Nanoyarn/Nanofibrous Scaffold，AYS)、取向納米纖維支架（Aligned Nanofibrous Scaffold，AFS）和三維多孔納米纖維支架（Three-dimensional porous Nanofibrous Scaffold，3DPS）3種不同結(jié)構的納米纖維材料，隨后將大鼠骨髓間充質(zhì)干

3、細胞(Bone Mesenchymal Stem Cell，BMSC)體外接種至這3種材料中，檢測BMSC在支架材料中黏附、生長、增殖和細胞活性;將AYS、AFS、3DPS材料種植于大鼠皮下，觀察囊壁厚度、異物巨細胞的形態(tài)數(shù)目，檢測炎性因子基因表達水平，評價三種材料的生物相容性;比較普通培養(yǎng)方法、間歇離心法以及生物反應器動態(tài)培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSC的效果，觀察細胞存活、生長和分布情況，優(yōu)化體外培養(yǎng)方法;體外靜態(tài)培養(yǎng)BMSC，觀察細胞在三種納米

4、纖維支架中的形態(tài)、黏附、增殖、分化等行為，比較纖維環(huán)細胞相關表型分子(COL2a1、COL1a1、Aggrecan、Sox-9)mRNA表達水平和細胞內(nèi)FAK信號通路相關蛋白AKT、ERK1/2、JNK、P38表達水平，評價不同結(jié)構納米纖維支架促進BMSC增殖分化的效果，并初步探索不同結(jié)構支架材料促進BMSC增殖和誘導分化的機制。
　　通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)AYS、AFS和3DPS三種納米纖維材料均具有良好的生物相容性;相對于普通培

5、養(yǎng)法和間歇離心法，生物反應器灌注培養(yǎng)法能更好地促進大鼠BMSC長入;不同結(jié)構的支架中，BMSC的細胞黏附、增殖、定向分化行為有顯著差異，AYS材料中，BMSC傾向于分化為成纖維細胞，3DPS材料中，BMSC傾向于分化為類軟骨細胞;在不同結(jié)構支架中的BMSC的Aggrecan、Sox-9基因表達量也有顯著差異，F(xiàn)AK信號通路相關蛋白AKT、P38表達水平有顯著差異，提示可能通過Integrin-FAK信號通路發(fā)揮促進增殖和誘導分化的作用。

6、
　　本研究深入研究了AYS、AFS、3DPS三種組織工程支架材料對BMSC行為的影響，并對其促進細胞增殖和定向分化的機制進行了初步研究，有助于進一步優(yōu)化纖維環(huán)組織工程支架產(chǎn)品，推進后續(xù)研究。
　　第一部分 納米紗/多孔納米纖維組織工程支架材料生物相容性研究
　　目的:通過體內(nèi)外實驗評價取向納米紗(AYS)、取向納米纖維支架(AFS)、三維多孔納米纖維支架(3DPS)材料的生物相容性。
　　方法:聚乳酸(PLLA

7、)、聚已內(nèi)酯(PCL)和明膠按不同比例配置通過靜電紡絲技術制備成取向納米紗(AYS)。聚乳酸(PLLA)和明膠混合采用常規(guī)靜電紡絲技術制作無規(guī)納米纖維，通過改變接收裝置，制備取向納米纖維支架(AFS)。無規(guī)納米纖維再經(jīng)過勻漿/凍干成型制成三維多孔納米纖維支架(3DPS)。將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)接種于上述支架材料。體外培養(yǎng)后檢測細胞在支架材料中黏附、生長情況、增殖、活性，評價體外生物相容性。將三種支架植入大鼠皮下，在不同時間點

8、取材，通過組織學染色、免疫組化、測量囊壁厚度、異物巨細胞的形態(tài)數(shù)目及炎性因子基因表達量，評價體內(nèi)生物相容性。
　　結(jié)果:體外實驗表明骨髓間充質(zhì)干細胞均能在三種材料上黏附、增殖，生長良好。體內(nèi)實驗表明三種材料在體內(nèi)早期（1-2周）均有較輕程度的炎性反應，4周后炎細胞浸潤減少，異物巨細胞數(shù)量逐漸減少。炎癥因子基因表達量趨勢與炎細胞浸潤相符。
　　結(jié)論:體內(nèi)外實驗結(jié)果證實該支架材料具有良好生物相容性，為進一步開發(fā)纖維環(huán)組織工程支架

9、材料應用奠定基礎。
　　第二部分 骨髓間充質(zhì)干細胞在支架材料中長入條件的優(yōu)化
　　目的:對比普通培養(yǎng)法、間歇離心法、生物反應器動態(tài)培養(yǎng)法三種不同培養(yǎng)條件下細胞生長存活情況，從而優(yōu)化培養(yǎng)方法。
　　方法:將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)接種于取向納米纖維支架(AFS)、取向納米紗(AYS)、三維多孔納米纖維(3DPS)支架材料，分別采用普通培養(yǎng)方法、間歇離心法以及生物反應器動態(tài)培養(yǎng)法進行培養(yǎng)。培養(yǎng)7、14天后，取出支架

10、進行如下檢測:HE染色觀察細胞在支架材料中生長情況;DAPI檢測細胞分布、活性;測量細胞長入深度。
　　結(jié)果:證實生物反應器灌注培養(yǎng)法細胞能更好地長入支架材料內(nèi)部，且存活良好。
　　結(jié)論:生物反應器灌注培養(yǎng)的動態(tài)培養(yǎng)方法更有利于細胞長入支架內(nèi)部，且細胞存活良好。
　　第三部分 不同結(jié)構納米纖維支架對骨髓間充質(zhì)干細胞行為的影響及其機制研究
　　目的:比較細胞在不同結(jié)構支架材料上的細胞形態(tài)以及黏附、增殖、分化等行為的

11、差異;比較不同支架內(nèi)纖維環(huán)細胞相關表型分子(COL2a1、COL1a1、Aggrecan、Sox-9)mRNA表達水平以及支架內(nèi)BMSC細胞中FAK信號通路相關蛋白表達差異。明確支架結(jié)構對細胞行為的影響，闡明其可能機制。
　　方法:將前期制備的三種支架材料消毒后備用。在體外將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)接種于三種不同結(jié)構支架內(nèi)，靜態(tài)培養(yǎng)3周后比較BMSC在三種纖維支架中細胞形態(tài)以及黏附、增殖、分化等行為的差異;提取細胞中cDN

12、A，qRT-PCR測定關鍵表型分子（COL2a1、COL1a1、Aggrecan、Sox-9）mRNA表達水平。通過Western blot對支架內(nèi)BMSC中相關蛋白AKT、ERK1/2、JNK、P38含量表達進行檢測。對比不同結(jié)構支架對細胞行為的影響。
　　結(jié)果:表明不同結(jié)構支架對細胞黏附、增殖、定向分化等細胞行為具有明顯影響，在取向性一致且致密結(jié)構的支架內(nèi)細胞形態(tài)類似成纖維細胞，且細胞外基質(zhì)Ⅰ型膠原含量更高，細胞更易向成纖維細