巨噬細(xì)胞游走抑制因子在復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征1型大鼠中的表達(dá)及意義.pdf

1、第一部分:復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征1型兩種大鼠造模方法的比較
　　背景：復(fù)雜區(qū)域疼痛綜合癥(Complex regional pain syndrome，CRPS)1型是以肢體痛覺異常為主要表現(xiàn)，涉及皮膚、血管、神經(jīng)、肌肉和骨關(guān)節(jié)等多系統(tǒng)損害的風(fēng)濕性疾病，臨床癥狀復(fù)雜，缺乏有效治療手段，多數(shù)病人長期忍受慢性疼痛并最終喪失勞動(dòng)力。盡管幾十年來學(xué)者不斷提出各種假說，但至今CRPS1型的病理機(jī)制仍不明確，相關(guān)研究進(jìn)展緩慢。直到2004年CR

2、PS1型大鼠模型的建立大大促進(jìn)了CRPS1型的基礎(chǔ)研究。目前Pubmed檢索到與CRPS1型大鼠實(shí)驗(yàn)相關(guān)的文獻(xiàn)主要采用的是兩種模型：大鼠骨折制動(dòng)后慢性痛(PFCP)模型及缺血加壓所致慢性缺血后疼痛(CPIP)模型。我們采用這兩種模型的方法分別進(jìn)行大鼠造模，探討兩種不同造模方法的區(qū)別，為實(shí)驗(yàn)選擇合適的大鼠造模方法提供參考依據(jù)。
　　目的:比較兩種復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征1型的大鼠造模方法的特點(diǎn)，分析兩種造模后大鼠的局部表現(xiàn)、疼痛行為、皮

3、膚及神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)改變、皮膚微循環(huán)以及血清P物質(zhì)(SP)、腫瘤壞死因子(TNF-α)的變化。
　　方法：成年SD健康大鼠32只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組，骨折制動(dòng)組及缺血加壓組，每組8只。所有大鼠造模前采血及測(cè)定疼痛閾值基線。假手術(shù)組給予石膏固定。骨折制動(dòng)組采用脛骨骨折彈力繃帶制動(dòng)石膏固定模型，缺血加壓組給以O(shè)形橡膠圈加壓模型分別造模。分別在造模結(jié)束后的第8h、24h、48h、4天、1周、2周、4周時(shí)測(cè)定疼痛行為。并于造模結(jié)束后

4、的第8h、1周、2周、4周采血測(cè)定SP、TNF-α的表達(dá)。4周時(shí)微循環(huán)檢測(cè)、取皮膚及坐骨神經(jīng)HE染色光鏡下觀察病理組織改變。
　　結(jié)果：骨折制動(dòng)組有3只出現(xiàn)斷肢，所剩5只造模8h后均出現(xiàn)疼痛閾值下降。缺血加壓組造模后大鼠均出現(xiàn)自發(fā)痛、痛覺過敏(疼痛閾值下降)及痛覺超敏(Q-tip陽性)改變，但癥狀波動(dòng)較骨折制動(dòng)組更為明顯。TNF-α及SP血清水平變化在兩造模組基本同步，在造模結(jié)束時(shí)表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05-0.01)

5、。與正常對(duì)照組比較，骨折制動(dòng)組與缺血加壓組均有明顯的皮膚微循環(huán)改變，以骨折制動(dòng)組更為明顯。兩組大鼠皮膚及坐骨神經(jīng)HE染色光鏡下結(jié)構(gòu)無明顯異常，骨折制動(dòng)組部分可見小潰瘍樣改變及坐骨神經(jīng)纖維輕度水腫。
　　結(jié)論：骨折后制動(dòng)造模與缺血加壓造模方法均可造成與復(fù)雜性局域疼痛綜合征1型相似的癥狀及病理改變。缺血加壓組癥狀波動(dòng)大，以急性早期CRPS1表現(xiàn)為主，而骨折制動(dòng)模型的癥狀及病理改變更為持續(xù)，可模擬早中期CRPS1的表現(xiàn)。
　　第二

6、部分：巨噬細(xì)胞游走抑制因子在復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征1型大鼠骨折模型中的表達(dá)
　　背景：復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征可因輕微的外傷、小手術(shù)誘發(fā)，表現(xiàn)為與刺激不成比例的慢性肢體疼痛及痛覺過敏，并伴隨局部皮膚、骨關(guān)節(jié)及交感神經(jīng)功能紊亂等一系列癥狀，其病理機(jī)制尚不清楚。自1942年Sudeck首次提出肢體局部炎癥反應(yīng)可能是CRPS1的主要發(fā)病原因之后，越來越多的證據(jù)說明CRPS1型的發(fā)生和維持與免疫炎癥關(guān)系密切。但對(duì)于CRPS1型的炎癥是局部、還是

7、全身性反應(yīng)至今仍存在質(zhì)疑，已找到的炎癥因子臨床意義亦不明確。因此尋找到具有診治意義的CRPSl型關(guān)鍵性炎癥因子是當(dāng)前CRPS1研究的突破點(diǎn)。
　　巨噬細(xì)胞游走抑制因子(MIF)作為重要的促炎因子在免疫相關(guān)性疾病中越來越受到重視，同時(shí)其作為神經(jīng)調(diào)節(jié)因子在神經(jīng)損傷及再生中的作用以及在疼痛發(fā)生及維持中的作用也逐漸被認(rèn)識(shí)。我們認(rèn)為具有神經(jīng)及免疫雙重調(diào)節(jié)作用的促炎因子MIF很可能為CPRS1型的關(guān)鍵性炎癥因子，成為CRPS治療的新靶點(diǎn)。

8、r>　　目的：探討巨噬細(xì)胞游走抑制因子在復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征1型大鼠骨折模型的血清、腦脊液、皮膚、坐骨神經(jīng)、脊髓的表達(dá)變化。
　　方法：32只成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分4組：正常對(duì)照組、假手術(shù)組、骨折對(duì)照組及模型組，每組8只。造模結(jié)束后，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)后處死。造模前后檢測(cè)大鼠后足疼痛行為。造模成功后的分別采用ELISA、Western blot、免疫組化方法分別測(cè)定MIF在各組大鼠的血清、腦脊液、皮膚、脊髓、坐骨神經(jīng)的表達(dá)。
　

9、　結(jié)果：ELISA檢測(cè)顯示MIF在CRPS1模型組大鼠的血清、腦脊液及皮膚、坐骨神經(jīng)、脊髓的表達(dá)均顯著上調(diào)(與各對(duì)照組比較，P<0.05-0.01)。Western blot顯示皮膚、坐骨神經(jīng)、脊髓的MIF表達(dá)顯著高于各對(duì)照組(P<0.05)。免疫組化顯示MIF在模型組皮膚及坐骨神經(jīng)強(qiáng)表達(dá)而在各對(duì)照組均為弱表達(dá)或無表達(dá)。
　　結(jié)論：MIF在CRPS1型各部位均表達(dá)上調(diào)，提示其可能廣泛參與了CRPS1型的病理過程。
　　第三部

10、分:靶向抑制巨噬細(xì)胞游走抑制因子在復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征1型大鼠骨折模型中的作用
　　背景：復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征(CRPS)1型在骨折或卒中后發(fā)病率可高達(dá)35％～64％，其病理機(jī)制仍不明確，迄今尚無統(tǒng)一的發(fā)病機(jī)制及治療模式。因缺乏有效治療手段，多數(shù)患者長期忍受慢性疼痛并最終致殘。僅有少量藥物可用于CRPS1型，而糖皮質(zhì)激素是目前唯一有證據(jù)能改善早中期CRPS1型患者預(yù)后(Grade1A)的藥物，但需長期大劑量服用。激素的副作用以及C

11、RPS1型本身存在的骨質(zhì)疏松限制了其臨床應(yīng)用。隨著免疫學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及炎癥因子的釋放參與了CRPS1型的發(fā)病，有證據(jù)表明炎癥因子靶向阻斷藥物在CRPS1型治療中可能有效。
　　巨噬細(xì)胞游走抑制因子(MIF)是炎癥反應(yīng)不可缺少的促炎因子，目前已被作為多種疾病炎癥活動(dòng)的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)而備受關(guān)注。已證實(shí)化合物S，R-3-4-羥苯-4，5-二氫-5-異噁唑乙酸甲酯又稱ISO-1可通過靶向阻斷MIF互變異構(gòu)酶

12、活性抑制MIF促炎的生物作用，達(dá)到抗炎作用。在上一章我們已通過ELISA、蛋白質(zhì)印跡、免疫組化等方法證實(shí)MIF在CRPS1型大鼠血、腦脊液、皮膚、坐骨神經(jīng)及脊髓中的表達(dá)上調(diào)，提示MIF可能廣泛參與CRPS1型的病理改變。我們擬進(jìn)一步探討靶向抑制MIF在CRPS1型中的作用，證實(shí)MIF在CRPS1型中的病理作用，并為CRPS1型治療提供新的治療靶點(diǎn)。
　　目的：與糖皮質(zhì)激素比較，探討靶向抑制MIF對(duì)CRPS1型大鼠的治療作用。

13、>　　方法：成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分9組：激素治療1組(n=7)進(jìn)行骨折制動(dòng)造模結(jié)束后以甲強(qiáng)龍1 mg/(kg·d)溶解于5％二甲基亞砜(DMSO)10 ul肌肉注射；激素治療2組(n=7)以甲強(qiáng)龍10mg/(kg·d)溶解于5％DMSO10 ul肌肉注射；靶向治療1組(n=7)進(jìn)行骨折制動(dòng)造模結(jié)束后給以MIF抑制劑ISO-1以0.1 mg/(kg·d)溶解于5％DMSO10 ul中稀釋后行皮下注射，連續(xù)14 d；靶向治療2組(n=7)

14、以ISO-11 mN(kg·d)；聯(lián)合治療1組(n=7)進(jìn)行骨折制動(dòng)造模結(jié)束后以ISO-10.1mN(kg·d)及甲強(qiáng)龍1mg/(kg·d)；聯(lián)合治療2組(n=7)進(jìn)行骨折制動(dòng)造模結(jié)束后以ISO-10.1mNg/(kg·d)及甲強(qiáng)龍10mg/(kg·d)；模型對(duì)照組(n=7)，骨折制動(dòng)造模給以皮下注射5％DMSO10 ul；假手術(shù)組(n=5)給以石膏假固定，并皮下注射5％DMSO10 ul；正常對(duì)照組(n=5)給以皮下注射5％：DMSO

15、10 ul；連續(xù)治療2周。治療前后檢測(cè)動(dòng)物疼痛行為，治療結(jié)束后第8h、1周、2周檢測(cè)血清MIF、SP水平，第2周時(shí)觀察各組大鼠患肢皮膚微循環(huán)。
　　結(jié)果：
　　(1)各治療組治療結(jié)束后的2周觀察期內(nèi)，大鼠肢體腫脹均輕于模型對(duì)照組(P<0.05)。各治療組血清SP均明顯低于模型對(duì)照組(P<0.05-0.01)。
　　(2)治療結(jié)束后第8h及第一周，除激素治療1組疼痛閾值與模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其他治療組的疼痛閾值均明顯高

16、于模型對(duì)照組(P<0.05)。治療結(jié)束后的整個(gè)觀察周期，ISO-1治療2組疼痛閾值始終高于ISO-1治療1組(P<0.05)。
　　(3)除激素治療1組及靶向治療1組血清MIF水平與模型對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)外，激素治療2組、靶向治療2組及聯(lián)合治療組血清MIF均明顯低于模型對(duì)照組(P<0.05)。
　　(4)ISO-1治療2組及聯(lián)合治療組的患肢微循環(huán)障礙積分明顯低于模型對(duì)照組及其他治療組(P<0.05)。

17、　　結(jié)論：
　　(1)MIF抑制劑ISO-1可顯著改善CRPS-1大鼠肢體腫脹、疼痛及局部微循環(huán)，并呈劑量依賴性。提示MIF參與了大鼠肢體腫脹、疼痛、微循環(huán)障礙的病理過程，靶向抑制MIF是治療CRPS1型的有效手段。
　　(2)激素可有效抑制MIF表達(dá)，達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛作用，但需要大劑量才見效，小劑量激素對(duì)大鼠肢體疼痛癥狀無影響。
　　(3)ISO-1抗炎鎮(zhèn)痛作用與大劑量激素相當(dāng)，但在改善微循環(huán)方面有優(yōu)勢(shì)。
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