基于TAK1-MAPK及NF-κB信號(hào)通路粉防己堿干預(yù)肝纖維化及隱丹參酮改善暴發(fā)性肝衰竭作用機(jī)制研究.pdf

1、本研究采用大鼠肝星狀細(xì)胞T‐HSC/Cl‐6和D‐氨基半乳糖/內(nèi)毒素聯(lián)合誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝衰竭動(dòng)物模型，分別探討粉防己堿抗肝纖維化和隱丹參酮肝保護(hù)作用機(jī)制，從細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及TAK1‐MAPK家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、NF‐κB信號(hào)通路等方面進(jìn)行研究。
　?。?）粉防己堿為傳統(tǒng)中藥防己的活性生物堿成分，我們采用腫瘤壞死因子‐α(TNF‐α)‐刺激大鼠肝星狀細(xì)胞T‐HSC/Cl‐6，闡明粉防己堿抗肝纖維化作用機(jī)制。永生化大鼠肝星狀細(xì)胞T‐

2、HSC/Cl‐6給予不同濃度的粉防己堿孵育1小時(shí)后，處理未處理TNF‐α(10 ng/ml)并孵育不同時(shí)間。同時(shí)人正常肝細(xì)胞Chang liver給予不同濃度的粉防己堿孵育24小時(shí)。粉防己堿(0.39‐50μM)濃度和時(shí)間依賴性抑制T‐HSC/Cl‐6細(xì)胞生長(zhǎng)率，然而濃度小于25μM時(shí)粉防己堿未對(duì)Chang liver細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞毒性。粉防己堿濃度和時(shí)間依賴性抑制caspase‐3及其底物PARP裂解，并結(jié)合膜聯(lián)蛋白‐v和碘化丙啶作為熒

3、光探針的流式細(xì)胞方法確認(rèn)25μM粉防己堿誘導(dǎo)T‐HSC/Cl‐6凋亡。同時(shí)，粉防己堿濃度和時(shí)間依賴性抑制α‐SMA蛋白表達(dá)。低濃度粉防己堿（6.25μM）未能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并影響α‐SMA蛋白表達(dá)。25μM粉防己堿顯著上調(diào)JNK和ERK及其上游激酶TAK1磷酸化，并啟動(dòng)NF‐κB P65核轉(zhuǎn)移與IκB‐α降解。另外，TNF‐α輕微抑制T‐HSC/Cl‐6細(xì)胞生長(zhǎng)率，粉防己堿濃度大于12.5μM時(shí)對(duì)TNF‐α刺激T‐HSC/Cl‐6呈現(xiàn)細(xì)胞

4、毒性。TNF‐α刺激后T‐HSC/Cl‐6的α‐SMA和TRADD蛋白表達(dá)時(shí)間依賴性增高，而預(yù)處理6.25μM粉防己堿能顯著下降α‐SMA和TRADD蛋白表達(dá)。預(yù)處理6.25μM粉防己堿降低JNK和TAK1磷酸化以及NF‐κB p65核轉(zhuǎn)移與IκBα降解。由此可見粉防己堿抗肝纖維化機(jī)制至少可能涉及細(xì)胞凋亡依賴和非依賴途徑，由其濃度決定。高劑量粉防己堿基于活化NF‐κB和磷酸化TAK1/JNK/ERK誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化；

5、低劑量粉防己堿抑制TNF‐α刺激肝星狀細(xì)胞的NF‐κB核轉(zhuǎn)移和TAK1/JNK磷酸化，從而抑制肝星狀細(xì)胞活化，可能經(jīng)細(xì)胞凋亡非依賴途徑。
　?。?）隱丹參酮為丹參的脂溶性活性成分，我們采用D‐氨基半乳糖/內(nèi)毒素聯(lián)合誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝衰竭小鼠模型探討隱丹參酮的肝保護(hù)作用機(jī)制。腹腔注射 D‐氨基半乳糖(700 mg/kg)/內(nèi)毒素(10μg/kg)12小時(shí)和1小時(shí)前，分別灌胃給予隱丹參酮(20或40 mg/kg)。D‐氨基半乳糖/內(nèi)毒素聯(lián)

6、合給藥后小鼠死亡率升高，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性及TNF‐α水平也增高，給予隱丹參酮后上述指標(biāo)顯著降低。隱丹參酮抑制caspase‐3、‐8和‐9活化，顯著改善D‐氨基半乳糖/內(nèi)毒素所致的肝細(xì)胞凋亡，并顯著降低細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)。隱丹參酮顯著抑制 JNK、ERK和 p38磷酸化以及 TAK1磷酸化。此外，隱丹參酮顯著抑制 NF‐κB活化并下調(diào)促炎癥細(xì)胞因子的生成。綜上所述，隱丹參酮的肝保護(hù)分子機(jī)制可能與抗凋亡活性有關(guān)，