sCD74在急性呼吸窘迫綜合征中的表達水平及其臨床意義.pdf

1、研究背景：
　　急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由多種直接致病因素（如肺挫傷、吸入性損傷、肺炎、誤吸、機械通氣）和間接致病因素（如感染、輸血、胰腺炎、創(chuàng)傷性腦損傷）引起的常見危重病征?；A(chǔ)研究證實，ARDS的本質(zhì)是炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞的損傷，其中炎性細胞因子和趨化因子構(gòu)成的復(fù)雜“網(wǎng)絡(luò)”在調(diào)節(jié)、放大、維持肺部炎癥過程扮演了重要角色。ARDS早期，

2、肺巨噬細胞可被巨噬細胞移動抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor，MIF)等炎性細胞因子活化，分泌其它多種炎癥因子(IL-1，IL-6，IL-8，IL-10，TNF-α)，同時促進趨化因子的釋放，進而募集、活化中性粒細胞?；罨闹行粤＜毎挚梢赃M一步釋放氧化物、蛋白酶、白三烯及其他炎癥介質(zhì)損傷肺組織。這提示，MIF可能是肺部炎性因子級聯(lián)反應(yīng)中處在較為上游的促炎因子。臨床研究發(fā)現(xiàn)MIF在AR

3、DS異常升高，提示MIF是潛在的ARDS發(fā)生和預(yù)后的重要生物標(biāo)志物，但其實際應(yīng)用價值并未確立。
　　2003年，Leng等發(fā)現(xiàn)CD74是MIF的高親和力受體。Takahashi等進一步發(fā)現(xiàn)MIF與CD74結(jié)合后激活下游信號通路，誘導(dǎo)炎癥因子的釋放，參與ARDS肺炎性損傷，抗CD74抗體可阻斷上述通路，抑制炎癥因子的表達，起到治療作用。2014年2月，Assis等率先在自身免疫性肝病患者的血清中檢測到CD74的可溶型形式，即可溶型C

4、D74(Soluble CD74，sCD74)，且其濃度顯著高于正常人群。此外，自身免疫性肝病患者外周sCD74主要是由肝星狀細胞分泌的，可競爭結(jié)合循環(huán)中升高的MIF并形成MIF-sCD74復(fù)合物，通過減少MIF與成纖維細胞膜上CD74的結(jié)合干擾MIF介導(dǎo)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而中和MIF的生物活性。根據(jù)既往研究基礎(chǔ)，MIF通過與膜表面CD74結(jié)合，啟動下游信號通路，誘導(dǎo)效應(yīng)蛋白表達，參與ARDS肺炎癥的發(fā)生。另一方面，sCD74來源于膜

5、表面CD74，并且能在患者血清中被檢測到，但sCD74在肺部疾病領(lǐng)域至今尚無文獻報道。因此，我們猜想sCD74與燒創(chuàng)傷所致ARDS具有何種關(guān)系呢？
　　為了闡明上述問題，我們開展了兩部分研究內(nèi)容。第一部分是采用經(jīng)典炎性肺損傷小鼠模型，比較肺損傷小鼠與正常小鼠肺組織CD74的表達量及外周sCD74的水平，并與肺損傷嚴(yán)重程度和炎癥程度進行相關(guān)性分析，以了解sCD74與ARDS可能存在的關(guān)系。隨后，通過細胞實驗探索sCD74的細胞來源和

6、生物學(xué)功能。第二部分是通過回顧性病例對照研究分析ARDS患者臨床數(shù)據(jù)和生物學(xué)指標(biāo)，驗證動物實驗結(jié)果，評估血清sCD74預(yù)測ARDS患者臨床結(jié)局的價值。
　　第一部分炎性肺損傷小鼠外周sCD74的表達水平及苴生物學(xué)作用初探（基礎(chǔ)實驗）
　　研究目的:(1)觀察sCD74在炎性肺損傷小鼠外周血及肺泡腔內(nèi)表達水平，探討sCD74與肺損傷嚴(yán)重程度的關(guān)系;(2)探索sCD74的細胞來源和生物學(xué)作用。
　　研究方法:建立脂多糖（L

7、ipopolysaccharide，LPS）氣道滴入和盲腸結(jié)扎穿刺(Cecalligation puncture，CLP)所致炎性肺損傷小鼠模型，在指定時間點取血清、肺組織、肺泡灌洗液等標(biāo)本;采用RT-PCR法檢測肺組織CD74的Mrna含量，Western blot法檢測肺組織CD74蛋白表達量，免疫組化和免疫熒光法對肺組織CD74進行定位;采用斑點印跡法及ELISA法檢測血清和肺泡灌洗液sCD74含量，分析sCD74及炎癥因子水平的

8、相關(guān)性;采用HE染色、肺泡灌洗液蛋白濃度、肺組織濕/干重比反應(yīng)肺損傷程度，分析sCD74與肺損傷程度的關(guān)系;采用rmMIF刺激巨噬細胞RAW264.7和肺上皮細胞MLE-12，檢測細胞CD74表達量及上清sCD74含量，并檢測細胞活性和凋亡情況;采用rmsCD74-FC與rmMIF同時或單獨刺激巨噬細胞RAW264.7，檢測上清炎癥因子水平。
　　研究結(jié)果:LPS氣道滴入和CLP所致炎性肺損傷小鼠與對照組相比，肺組織CD74在基因

9、和蛋白層面均表達增高;免疫組化和免疫熒光染色顯示CD74主要位于肺巨噬細胞膜表面:炎性肺損傷小鼠血清和肺泡灌洗液sCD74含量明顯高于對照組，并且與肺組織損傷程度相關(guān):此外，肺泡灌洗液sCD74濃度與MIF、TNF-α、IL-6成正相關(guān):rmMIF刺激巨噬細胞RAW264.7可于上清檢測到sCD74，而rmMIF刺激肺上皮細胞MLE-12無sCD74釋放;當(dāng)?shù)蜐舛萺msCD74-Fc（10-～200ng/ml）與rmMIF同時刺激巨噬細

10、胞RAW264.7時，rmMIF引起的TNF-α和MIP-2的釋放被抑制;sCD74單獨刺激RAW264.7亦可引起炎癥因子釋放。
　　研究結(jié)論:(1)炎性肺損傷會引起肺組織CD74表達增高，及血清和肺泡腔內(nèi)sCD74水平增高，且sCD74水平與炎性肺損傷嚴(yán)重程度和肺炎癥程度成正相關(guān)關(guān)系;(2)巨噬細胞是sCD74的細胞來源之一，sCD74不僅可中和MIF的促炎作用，亦可刺激炎癥的發(fā)生。
　　第二部分 sCD74在燒創(chuàng)傷所致

11、ARDS中的臨床意義（臨床試驗）
　　研究目的:探討ARDS患者血清sCD74水平的變化及其對ARDS患者臨床結(jié)局的預(yù)測價值。
　　研究方法:采用回顧性研究（Clinical Trial注冊號:NCT02201446），以ELISA法檢測81例符合ARDS柏林診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者血清sCD74的含量，比較第1日和第3日水平，并與58例健康志愿者作比較;根據(jù)ARDS患者結(jié)局分為存活組與死亡組，比較兩組一般數(shù)據(jù)及血清sCD74等指標(biāo)的

12、差異;采用ROC曲線評估各檢測指標(biāo)預(yù)測ARDS患者預(yù)后的價值;采用線性回歸和Logistic分析法分析sCD74對ARDS患者預(yù)后的影響。
　　研究結(jié)果:ARDS患者平均年齡48.02±16.05歲，其中男性患者44例（占比54.3％），創(chuàng)傷所致ARDS為35例（占比43.2％），吸入性損傷所致ARDS為46例（占比56.8％），入院當(dāng)日APACHEⅡ評分為14.35±6.39，接收機械通氣患者51例(63.0％)，28天脫機時間

13、中位數(shù)為22天，氧合指數(shù)為2.1±0.46，ICU住院時間中位數(shù)為23天，死亡患者14例(17.3％);死亡患者與存活患者在原發(fā)致傷因素、APACHEⅡ評分、機械通氣、28天脫機時間、氧合指數(shù)經(jīng)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。ARDS患者第1日血清MIF、TNF-α、IL-6、sCD74濃度分別為73.64±23.27ng/ml，97.09(92.32，100.82)pg/ml，101.63(79.5，138.9)pg/ml，

14、75.83(65.76，96.36)ng/ml，第3日血清MIF、TNF-α、IL-6、sCD74濃度分別為129.27±41.12ng/ml，138.67±64.26pg/ml，305.36±177.14pg/ml，117.0(105.2，160.1)ng/ml，均顯著增高。死亡患者第1日血清sCD74濃度77.96(65.82，124.63)ng/ml高于存活患者75.25(64.99，95.74)ng/ml，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p

15、＞0.05);然而，死亡患者第3日血清sCD74濃度[(160.9(133.7，179.3)]與存活患者[115(103.9，147.0)]相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)?；颊叩?日血清sCD74與MIF、TNF-α、IL-6均成正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)分別為:r=0.333，p＜0.01;r=0.409，p＜0.01;r=0.303，p＜0.05)。第1日、第3日血清MIF預(yù)測患者死亡的ROC曲線下面積分別為0.58，95％CI

16、:(0.38-0.78)和0.52，95％CI:(0.38-0.72)，第1日、第3日血清sCD74預(yù)測患者死亡的ROC曲線下面積分別為0.47，95％CI:(0.29-0.64)和0.75，95％CI:(0.61-0.89)。生存分析結(jié)果顯示第3日血清sCD74＜151 ng/ml組患者生存率高于sCD74＞151 ng/ml組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);第1日血清sCD74＜118 ng/ml組患者生存率高于sCD74＞11

17、8 ng/ml組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。線性回歸分析顯示第3日血清sCD74每增加1ng/ml，呼吸機使用天數(shù)增加0.11天，多元Logistic回歸分析顯示sCD74是ARDS患者死亡的獨立危險因素（第1日血清sCD74:OR=13.21，95％CI:0.83-209.79，p=0.067;第3日血清sCD74:OR=6.72，95％ CI，1.435-31.4，p=0.016)。
　　研究結(jié)論:ADRS患者早期血