黏質(zhì)沙雷菌多位點(diǎn)序列分型方法的建立及其耐藥性研究.pdf

1、目的：
　　建立黏質(zhì)沙雷菌多位點(diǎn)序列分型（MLST）方法，研究黏質(zhì)沙雷菌菌株耐藥性及其流行性特點(diǎn)，為控制黏質(zhì)沙雷菌的醫(yī)院感染、預(yù)防黏質(zhì)沙雷菌流行性感染和臨床合理使用抗菌藥物提供依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)對象：
　　收集2013年9月至2014年12月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院分離的65株黏質(zhì)沙雷菌，收集其標(biāo)本來源，科室分布，患者年齡、性別及耐藥結(jié)果等信息。網(wǎng)上下載26株標(biāo)準(zhǔn)菌株。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.對收集2013年9

2、月至2014年12月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院分離的65株黏質(zhì)沙雷菌來源，科室分布，患者年齡、性別及耐藥性的統(tǒng)計(jì)。網(wǎng)上下載26株標(biāo)準(zhǔn)菌株序列統(tǒng)計(jì)。
　　2.對菌株分離純化，K-B法測藥敏。
　　3.細(xì)菌培養(yǎng)與基因組DNA的提取接種培養(yǎng)及試劑盒提取DNA于-20℃?zhèn)溆谩?.黏質(zhì)沙雷菌多位點(diǎn)序列分型管家基因引物設(shè)計(jì)與 PCR擴(kuò)增選取7個(gè)管家基
　　因dnaA、gyrB、recA、infB、pgi、adk、rpoB，設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)

3、行PCR擴(kuò)增。
　　5. PCR產(chǎn)物序列比對和基因進(jìn)化分析。PCR特異性擴(kuò)增，送上海生工公司測序。整理每菌株各個(gè)基因的序列結(jié)果，bioedit軟件編輯序列。DnaSPv5、Splits tree、CLUSTALW（http://www.genome.jp/tools/clustalw/）、eBurstV3等，對序列的GC含量、等位基因數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、聚類、進(jìn)化樹等進(jìn)行分析，確定與探討菌株間的進(jìn)化關(guān)系。
　　結(jié)果：
　

4、　1.黏質(zhì)沙雷菌標(biāo)本來源主要是痰液（63.1％）尿液(12.3%)、傷口(9.2%)；黏質(zhì)沙雷菌的科室分布主要為呼吸內(nèi)科病房(55.4%)，血液科(15.4%)及重病監(jiān)護(hù)室（9.2%)；黏質(zhì)沙雷菌分離株來源男性多余女性，占總菌數(shù)的64.6%，50歲以上的患者占整體患者的75.4%。
　　2.65株黏質(zhì)沙雷菌分離菌株對常見13種抗菌藥物的耐藥率在10%~53.8%之間，其中耐藥率最高的是哌拉西林為53.8%；對碳青霉烯類抗生素亞胺培

5、南的耐藥非常嚴(yán)重，耐藥率為33.3%，對氨基糖苷類（阿米卡星）最為敏感為86.2%。
　　3. MLST分析26株下載標(biāo)準(zhǔn)菌株定義了18個(gè)ST型，65株待測菌株定義了38個(gè) ST型；7個(gè)管家基因中，基因型在25個(gè)至35個(gè)之間，以 rpoB基因的基因型最多(35個(gè))，其次為gyrB（33個(gè)），基因型最少的基因是adk；多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)在34~98之間，gyrB的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)最多（98個(gè)），adk的多態(tài)性最少（34），多態(tài)性位點(diǎn)突變率在7

6、.2%~13.0%之間，突變率最大的為gyrB（13.0%），最小值為adk（7.2%）；7個(gè)管家基因的平均 GC含量在58.0%~61.9%之間，最大的是 gyrB（61.9%），其次是recA（58.0%）；dN/dS的范圍從0（infB）到0.0494（adk），infB的dN/dS為0提示著infB處于很強(qiáng)的選擇壓力下。
　　4. Splits tree軟件分析黏質(zhì)沙雷菌株和其 ST型的進(jìn)化樹，結(jié)果顯示分別分為Cluste

7、r1、Cluster2、Cluster3、Cluster4、Cluster5和Cluster A、Cluster C、Cluster D、Cluster E聚合群。
　　5.黏質(zhì)沙雷菌多位點(diǎn)序列CLUSTALW聚類分析定義了56個(gè)ST型，以ST25的序列型形成了一個(gè)克隆復(fù)合體CC25。
　　6.eBurstV3黏質(zhì)沙雷菌分離株的聚類分析中形成了5個(gè)組和39個(gè)獨(dú)立型，4個(gè)雙聯(lián)體。
　　7. Tajima's D、Fu a

8、nd Li’s D*及Fu and Li’s F*的中性試驗(yàn)分析只有基因rpoB等位基因的同義替換有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.本院不同科室的易感人群不同，以50歲以上的男患者為主引起呼吸道及尿道感染。
　　2.黏質(zhì)沙雷菌對碳青酶烯類抗菌藥物耐藥率較高，且多為泛耐藥菌株；黏質(zhì)沙雷菌的分子流行病學(xué)趨勢相對較慢，在基因組上高度保守，目前需要重點(diǎn)監(jiān)測以ST25型為代表黏質(zhì)沙雷菌 CC25克隆復(fù)合體的流行，以防其在醫(yī)院的