鮑氏不動(dòng)桿菌多位點(diǎn)序列分型以及相關(guān)耐藥基因檢測(cè).pdf

1、目的:
　　選用巴斯德研究所(Institute Pasteur)鮑氏不動(dòng)桿菌多位點(diǎn)序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)方案，對(duì)臨床來(lái)源的多種藥物耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌分離株進(jìn)行MLST分型，并應(yīng)用多種軟件分析鮑氏不動(dòng)桿菌的種群結(jié)構(gòu)和群體遺傳學(xué)特征;PCR擴(kuò)增多重耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌臨床分離株6種OXA型碳青霉烯酶基因（blaOXA-23-like，blaOXA-24-like，blaOXA-58-l

2、ike，blaOXA-51-like，blaOXA-69-like和blaOXA-143-like）以及插入序列blaISAba1的攜帶情況，以了解鮑氏不動(dòng)桿菌中碳青霉烯類(lèi)抗生素產(chǎn)生抵抗力可能的分子基礎(chǔ)和遺傳學(xué)機(jī)制;分析臨床來(lái)源的耐環(huán)丙沙星鮑氏不動(dòng)桿菌中，9個(gè)質(zhì)粒來(lái)源的喹諾酮藥物耐藥相關(guān)基因(qnrA，qnrB，qnrC，qnrD，qnrS，qepA，aac(6')-Ib-cr，oqxA和oqxB基因）攜帶情況，以及染色體喹諾酮耐藥決定

3、區(qū)基因(gyrA，gyrB，parC和parE基因)發(fā)生耐藥性突變情況，并推測(cè)臨床來(lái)源的鮑氏不動(dòng)桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)抗生素可能的遺傳學(xué)機(jī)制。
　　方法:
　　1.臨床來(lái)源的多重耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌MLST分型:
　　收集國(guó)內(nèi)幾家醫(yī)院分離的多重耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌，依照巴斯德研究所鮑氏不動(dòng)桿菌MLST分型方案，分別針對(duì)7個(gè)看家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序。7個(gè)看家基因測(cè)序結(jié)果與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的相應(yīng)等位基因序列比對(duì)后，得到了各菌株的等

4、位基因譜和ST型。應(yīng)用Bionumeric6.6、eBURST v3.0、MEGA5.1、SplitTree4.0、START2.0和RDP v3.44等軟件進(jìn)行分析，以獲得鮑氏不動(dòng)桿菌種群結(jié)構(gòu)和群體遺傳學(xué)特征。
　　2.臨床來(lái)源鮑氏不動(dòng)桿菌中OXA型碳青霉烯酶基因檢測(cè):
　　應(yīng)用多重PCR技術(shù)同時(shí)擴(kuò)增鮑氏不動(dòng)桿菌中五種OXA型碳青霉烯酶基因（blaOXA-51-like，blaOXA-23-like，blaOXA-24-l

5、ike， blaOXA-58-like和blaOXA-143-like基因）。另外，單獨(dú)擴(kuò)增blaOXA-69-like， blaISba1F-OXA51R，blaISba1F-OXA23R以及blaISAba1基因，并對(duì)blaOXA-69-like基因陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，并與NCBI中已知基因序列進(jìn)行比對(duì)。
　　3.耐環(huán)丙沙星鮑氏不動(dòng)桿菌中喹諾酮耐藥相關(guān)基因檢測(cè):
　　應(yīng)用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增耐環(huán)丙沙星鮑氏不動(dòng)桿菌中9

6、個(gè)質(zhì)粒攜帶的喹諾酮類(lèi)耐藥基因(qnrA，qnrB，qnrC，qnrD，qnrS，qepA，aac(6')-Ib-cr，oqxA和oqxB基因），各基因PCR擴(kuò)增并測(cè)序后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知基因比對(duì);對(duì)臨床來(lái)源鮑氏不動(dòng)桿菌環(huán)丙沙星耐藥株染色體喹諾酮耐藥決定域基因，包括gyrA，gyrB，parC和parE進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后與參考菌株ATCC17978相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)，以了解鮑氏不動(dòng)桿菌喹諾酮耐藥決定區(qū)耐藥性突變情況。

7、
　　結(jié)果:
　　1.鮑氏不動(dòng)桿菌多重耐藥株MLST分型:
　　共計(jì)247株多重耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌的7個(gè)看家基因進(jìn)行了成功的PCR擴(kuò)增以及測(cè)序。7個(gè)看家基因，包括cpn60，fusA，gltA，pyrG，recA，rplB和rpoB獲得的等位基因數(shù)目分別為13，10，10，8，10，8和12個(gè)，其中包括提交核酸序列至巴斯德網(wǎng)站后獲得的14個(gè)新等位基因，包括:cpn60(46)，cpn60(47)，cpn60(48)，cp

8、n60(49); fusA(46)，fusA(47); gltA(49),gltA(50); recA(49); rpoB(42),rpoB(43),rpoB(48),rpoB(49),rpo B(50)。所有菌株分屬于23個(gè)ST型，包括:ST2，ST63，ST68，ST104，ST113，ST185，ST187, ST193, ST207, ST214, ST215, ST216, ST217, ST218, ST219, ST220

9、, ST221,ST222，ST223，ST224，ST225，ST226和ST227。有83.8％(207/247)菌株屬于ST2型，且ST2型菌株在6個(gè)菌株來(lái)源城市（或醫(yī)院）都有分布。應(yīng)用Bionumeric6.6構(gòu)建了最小生成樹(shù);應(yīng)用MEGA5.1構(gòu)建了本研究中所有菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù);eBURST v3.0分析顯示本研究中的菌株主要分布于10個(gè)克隆群，其中有86.6％的菌株分布于克隆群2（包括214株菌，5種ST型），此外還包括

10、6個(gè)Singletons;應(yīng)用SplitTree4.0構(gòu)建了網(wǎng)狀進(jìn)化樹(shù);START2.0計(jì)算出ISA=0.8373，顯示連鎖不平衡;RDP v3.44估計(jì)到了4個(gè)可信的重組事件。
　　2.臨床來(lái)源鮑氏不動(dòng)桿菌OXA型碳青霉烯酶基因檢測(cè):
　　多重PCR結(jié)果顯示，所有菌株blaOXA-51-like基因攜帶率達(dá)94.7％(n=234)，是攜帶率最高的OXA型碳青霉烯酶耐藥基因;blaOXA-23-like基因攜帶率為74.1％

11、(n=183); blaOXA-58-like基因攜帶率為0.8％(n=2);所有菌株均未檢測(cè)到攜帶blaOXA-24-like或blaOXA-143-like基因。此外，blaISbaIF-OXA51R陽(yáng)性率為10.5％(n=26); blaISba1F-OXA23R陽(yáng)性率為10.5％(n=26);插入序列blaISAba1陽(yáng)性率高達(dá)96.4％(n=238)。blaOXA-69-likePCR擴(kuò)增陽(yáng)性率達(dá)83.4％(n=206)，其擴(kuò)

12、增產(chǎn)物經(jīng)雙向測(cè)序后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列比對(duì)顯示具有高度同源性。
　　基于所有OXA型碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果的組合，進(jìn)行耐藥基因分型，共獲得了25種耐藥基因型。其中基因型1（blaOXA-51-like+blaOXA-23-like+blaISba1F-OXA23R+blaOXA-69-like+blaISAba1）菌株數(shù)量最多(n=146，59.1％)。其它基因型菌株數(shù)量較少。
　　3.耐環(huán)丙沙星鮑氏不動(dòng)桿菌中喹諾酮類(lèi)

13、耐藥相關(guān)基因檢測(cè):
　　所有菌株均未檢出攜帶任何質(zhì)粒來(lái)源的喹諾酮類(lèi)耐藥基因，但aac(6')-Ib基因攜帶率為83.3％(95/114)，提示這些菌株可能同時(shí)具有氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥性。染色體喹諾酮耐藥決定區(qū)基因，包括gyrA，gyrB，parC和parE基因的測(cè)序結(jié)果與敏感株相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，絕大部分菌株(113/114，99.1％)的gyrA基因發(fā)生了Ser83Leu突變，其中67株菌(67/114，58.8％)還同

14、時(shí)發(fā)生了parC基因的Ser80Leu突變，以上兩種突變是常見(jiàn)的喹諾酮耐藥相關(guān)突變。與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比對(duì)，受試菌株gyrB基因Arg393Ser、Arg393Cys、Thr401Ala、Pro406Ser、Va1430Phe、Cys440Ser和Gly480Arg突變率分別為95.6％，0.9％，96.5％，96.5％，100％，96.5％，96.5％; parE基因在七個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了同義突變，突變率為96％以上。
　　將所有菌株gy

15、rA、gyrB、parC和aac(6')-Ib的結(jié)果匯總進(jìn)行菌株分型，共得到了8種基因型。其中，基因型1菌株數(shù)目最多，包括62株菌，其特點(diǎn)是具有已知與環(huán)丙沙星耐藥相關(guān)的GyrA-Ser83Leu和ParC-Ser80Leu雙突變，gyrB中包括7種非同義突變，以及aac(6')-Ib擴(kuò)增陽(yáng)性;其次為基因型5（32株菌），其與基因型1的區(qū)別是沒(méi)有ParC-Ser80Leu氨基酸改變，以上兩種基因型占所有菌株的絕大多數(shù)(94/114，82.

16、5％)。
　　結(jié)論:
　　ST2型菌株是國(guó)內(nèi)乃至世界范圍內(nèi)鮑氏不動(dòng)桿菌流行的主要菌株，其菌株數(shù)量最多且流行范圍廣泛。本研究中估計(jì)到了4個(gè)種群內(nèi)的重組事件，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)聯(lián)指數(shù)ISA=0.8373，證實(shí)種群中存在連鎖不平衡，且86.6％(214株)的菌株分布于高度適應(yīng)性克隆群2，進(jìn)一步證實(shí)了鮑氏不動(dòng)桿菌的epidemic種群結(jié)構(gòu)特征。
　　臨床鮑氏不動(dòng)桿菌多重耐藥株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素產(chǎn)生抵抗性的原因，可能與OXA23和O