動(dòng)物源性腸球菌多位點(diǎn)序列分型及質(zhì)粒檢測(cè).pdf

1、腸球菌是一類球形或卵圓形，不形成芽孢，常以成對(duì)或短鏈形式存在的需氧或兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性球菌，且為條件性致病菌，廣泛存在于水、土壤等環(huán)境中，是人和動(dòng)物體胃腸道正常菌群之一，糞腸球菌和屎腸球菌是其優(yōu)勢(shì)菌種。臨床上由于抗生素的濫用，多重耐藥菌株的出現(xiàn)，使腸球菌的感染率不斷上升，成為感染的要病原菌。
　　雖然腸球菌被習(xí)慣性認(rèn)為腸球菌是人和動(dòng)物腸道共生的條件性致病菌，但它們能獲得特定的遺傳性狀，如毒力和耐藥性等因素，這也提高了其在復(fù)雜環(huán)境

2、中的適應(yīng)能力，使得許多耐藥菌株大量出現(xiàn)和蔓延。腸球菌對(duì)現(xiàn)有的大多數(shù)抗菌藥物天然耐藥(如青霉素類、頭孢類抗菌藥物)，使其不易從感染部位清除。腸球菌易通過(guò)點(diǎn)突變和移動(dòng)遺傳因素獲得耐藥性，最常見(jiàn)的方式是接合或者通過(guò)質(zhì)粒的水平傳輸或轉(zhuǎn)座子。有研究表明幾個(gè)確定質(zhì)粒無(wú)論是位點(diǎn)特異性重組或同源重組轉(zhuǎn)座子能共轉(zhuǎn)移和整合進(jìn)染色體中。腸球菌中質(zhì)粒的流行性和重要性在動(dòng)物、食品和人的野生型腸球菌耐藥性的傳播中具有重要作用是未知的。質(zhì)粒是可塑的和動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，它常被

3、認(rèn)為不同的特定功能如維護(hù)（復(fù)制，穩(wěn)定性和拷貝數(shù)控制），轉(zhuǎn)讓（移動(dòng)和轉(zhuǎn)移），致病性（致病島和毒力基因），降解途徑（生化特性）和抗性功能（抗微生物，重金屬）。最近的一些研究表明，這些模塊進(jìn)化中保留該宿主特異性。
　　目前，國(guó)外對(duì)腸球菌致病性的研究較多，而國(guó)內(nèi)則較少。由于細(xì)菌的進(jìn)化與所處環(huán)境有著非常密切的關(guān)系，所以不同地區(qū)的菌株會(huì)有著自身的特點(diǎn)，然而關(guān)于腸球菌的流行病學(xué)和種群結(jié)構(gòu)知道很少。
　　本研究以90株不同來(lái)源腸球菌分離株為

4、研究對(duì)象，應(yīng)用多位點(diǎn)序列分型(MLST)技術(shù)，根據(jù)GenBank公布的腸球菌基因組上7個(gè)不同管家基因設(shè)計(jì)特異性引物，糞腸球菌gdh葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、gyd甘油醛-3-磷酸脫氫酶、pstS磷酸ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)、gik葡萄糖激酶、aroE草酸-5-脫氫酶、xpt黃嘌呤磷酸、yiqL乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶；adk（腺苷酸激酶），atpA（ATP合成酶，α亞基），ddl（D-丙氨酸連接酶），gyd（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、pstS（磷酸

5、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體、purK（烯醇丙酮酸羧化酶ATP酶亞基）。以不同來(lái)源的腸球菌DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出各個(gè)管家基因，經(jīng)膠回收純化，送公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得到等位基因圖譜，構(gòu)建等位基因圖譜并確立序列型(STs)，進(jìn)而對(duì)90株腸球菌進(jìn)行分型，系統(tǒng)分析菌株間的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系。然后進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)調(diào)查和菌群遺傳分析及流行病學(xué)分析。MLST結(jié)果分析表明腸球菌共54個(gè)ST型，其中糞腸球菌和屎腸球菌各占27個(gè)ST型。糞腸球菌主要

6、分布在ST16有9株；ST163、ST238和ST631分別4株；ST69、ST138、ST330、ST363、ST597分別有3株，其余各ST型到只包含1或2株菌。屎腸球菌主要分布ST178、ST190分別有2株菌，其余如ST22、ST26等各個(gè)ST僅僅包含1株菌。
　　隨后為研究腸球菌其質(zhì)粒攜帶情況，來(lái)自腸球菌公布的12種質(zhì)粒序列，根據(jù)其復(fù)制起始基因（rep)進(jìn)行序列比對(duì)，使用其蛋白和 DNA水平80％的一致性，設(shè)計(jì)引物，摸索

7、不同質(zhì)粒的PCR條件，每個(gè)質(zhì)粒在所測(cè)菌株中進(jìn)行試驗(yàn)多次篩選直到有菌株中出現(xiàn)某種質(zhì)粒，然后送公司測(cè)序，將序列正確的作為陽(yáng)性質(zhì)粒，再對(duì)其它菌株進(jìn)行檢測(cè)。如果某種質(zhì)粒在所測(cè)菌株中均沒(méi)有出現(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)中暫定為陰性。本研究對(duì)不同來(lái)源的65株腸球菌進(jìn)行質(zhì)粒流行性測(cè)試結(jié)果表明，rep9家族在糞腸球菌中最普遍，而rep2在是屎腸球菌中最常見(jiàn)；65株糞腸球菌中有8株檢測(cè)到質(zhì)粒，所檢測(cè)出的質(zhì)粒分別是pIP501(分離株N9、N41)，pRE25（N1、N5