中國部分地區(qū)鮑曼不動桿菌多位點序列分型及碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制研究.pdf

1、碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌(Carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)在我國各地的廣泛出現(xiàn)和流行，給臨床治療帶來了極大的困難。應(yīng)用分子分型技術(shù)對我國各個地區(qū)的CRAB進(jìn)行系統(tǒng)全面的分子流行病學(xué)研究，闡明我國CRAB的流行分布情況，將為制訂科學(xué)、有效的預(yù)防和控制措施提供理論依據(jù)。
　　 本研究第一部分收集了2005年中國16個城市24家三級醫(yī)院的分離的226株非重復(fù)的鮑曼

2、不動桿菌，包括152株CRAB菌株和74株碳青霉烯類抗生素敏感鮑曼不動桿菌(Carbapenem-susceptibleAcinetobacterbaumannii，CSAB)，應(yīng)用多位點序列分型(Multilocussequencetyping，MLST)技術(shù)對這些菌株進(jìn)行分子分型，并將結(jié)果與細(xì)菌分子分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”脈沖場凝膠電泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)結(jié)果進(jìn)行比較，分析MLST技

3、術(shù)應(yīng)用于鮑曼不動桿菌分子流行病研究的可行性；應(yīng)用eBURST軟件對MLST數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，推測菌株的進(jìn)化關(guān)系，并與國外鮑曼不動桿菌MLST分型結(jié)果進(jìn)行比較分析；測定了11種抗菌藥物的體外敏感性試驗；應(yīng)用PCR檢測了菌株攜帶的碳青霉烯類抗生素耐藥基因。
　　 MLST結(jié)果顯示，CRAB菌株的遺傳背景相對單一，包含8個序列型(Sequencetype，ST)，其中ST92及其單個位點變異型(Singlelocusvariant，SLV

4、)ST90和ST75為主要流行ST型，其次為ST91型。CSAB菌株具有更多樣性的遺傳背景，包含36個ST型，ST92也是CSAB菌株中最主要的ST型。
　　 PFGE將226株鮑曼不動桿菌分為44個脈沖型。整體上看，PFGE與MLST的結(jié)果具有較好的一致性，但是在對ST92及其SLVs菌株的區(qū)分上，PFGE和MLST存在部分的差異。與PFGE相比，MLST對菌株同源性的判定更為保守，可以反映菌株較長時間內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系。
　

5、　 將MLST數(shù)據(jù)與鮑曼不動桿菌網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫Pubmlst(http://pubmlst.org/abaumannii/)中數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)ST92及其SLVs屬于克隆復(fù)合體92(Clonalcomplex92，CC92，原名CC22)，是目前數(shù)據(jù)庫中最主要克隆復(fù)合體，其菌株來源包括了亞洲、歐洲、大洋洲和美洲的多個國家，證實CC92存在世界性的廣泛流行，且中國流行的CRAB菌株與國外流行的菌株在進(jìn)化上來自于相同的祖先。
　　

6、 CC92和ST91型鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類、第三和第四代頭孢菌素、氨基糖苷類、米諾環(huán)素和氟喹諾酮的耐藥性均要高于其他ST型鮑曼不動桿菌(P<0.001)。ST92-CRAB與ST92-CSAB相比，除碳青霉烯類抗生素以外，對以上其他抗菌藥物的耐藥率無統(tǒng)計學(xué)差異，提示多重耐藥是ST92型菌株的重要特征。
　　 blaOXA-23是CRAB菌株攜帶的最主要的獲得性的碳青霉烯酶基因。ST91型CRAB菌株同時攜帶了blaOXA-

7、23和blaOXA-58。CSAB菌株中均未檢測到獲得性的碳青霉烯酶基因。blaOXA-23陽性的ST92型CRAB菌株對亞胺培南的最小抑菌濃度(Minimalinhibitoryconcentration，MIC)是blaOXA-23陰性的ST92型CSAB菌株的32-128倍，提示blaOXA-23是造成ST92型鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的關(guān)鍵因素。
　　 本研究第一部分應(yīng)用了MLST分型技術(shù)對國內(nèi)多個城市的鮑曼不

8、動桿菌進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)克隆復(fù)合體CC92是我國甚至全球流行范圍最廣的CRAB克隆，且具有很強(qiáng)的耐藥性。OXA-23型碳青霉烯酶基因是介導(dǎo)CC92對該類抗生素耐藥的重要因素。CC92在國內(nèi)的出現(xiàn)和播散是我國鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥率不斷升高的重要原因。
　　 具有碳青霉烯類抗生素水解能力的D類β-內(nèi)酰胺酶(CarbapenemhydrolyzingclassDβ-lactamase，CHDL)是介導(dǎo)鮑曼不動桿菌

9、對碳青霉烯類抗生素耐藥的最重要機(jī)制。blaOXA-58是一種呈全球分布的CHDL基因。本研究第一部分發(fā)現(xiàn)ST91型CRAB同時攜帶了blaOXA-23型和blaOXA-58型碳青霉烯酶基因。第二部分在此基礎(chǔ)上，對攜帶blaOXA-58基因的不動桿菌的遺傳背景特征、質(zhì)粒特征及blaOXA-58基因的周圍結(jié)構(gòu)與耐藥表型間的聯(lián)系進(jìn)行了深入研究。
　　 第二部分研究收集了13株攜帶blaOXA-58基因的非重復(fù)的不動桿菌，來自自國內(nèi)6個

10、城市的7家三級醫(yī)院，包括了2株pittii不動桿菌(即不動桿菌基因種型3)，3株nosocomialis不動桿菌(即不動桿菌基因種型13TU)和8株鮑曼不動桿菌(其中兩株浙江金華的鮑曼不動桿菌來自在第一部分研究)。應(yīng)用PFGE和MLST對這些菌株進(jìn)行分子流行病學(xué)研究；測定所有菌株對13種抗菌藥物的MIC值；應(yīng)用Southern雜交確定blaOXA-58的基因定位；應(yīng)用質(zhì)粒抽提和電轉(zhuǎn)化確定攜帶blaOXA-58質(zhì)粒的可傳播性；應(yīng)用限制性酶

11、切、克隆技術(shù)分析blaOXA-58的基因周圍序列；應(yīng)用基于PCR的鮑曼不動桿菌質(zhì)粒復(fù)制子分型法(AcinetobacterbaumanniiPCR-basedreplicontyping，AB-PBRT)對不同菌株中攜帶blaOXA-58的質(zhì)粒進(jìn)行分型研究。
　　 PFGE分型發(fā)現(xiàn)，2株pittii不動桿菌屬于同一個脈沖型(分別來自浙江杭州和浙江臺州)，3株nosocomialis不動桿菌分屬于2個脈沖型(均來自浙江溫州)，8株

12、鮑曼不動桿菌可分為3個脈沖型。8株鮑曼不動桿菌可分為3個ST型。其中，ST91在浙江金華和湖北武漢的醫(yī)院出現(xiàn)，且浙江金華中心醫(yī)院2004年和2009年均分離到了ST91型產(chǎn)OXA-58型碳青霉烯酶的鮑曼不動桿菌，提示其存在地方性流行。
　　 13株不動桿菌表現(xiàn)出不同的碳青霉烯類抗生素敏感性表型。pittii不動桿菌和nosocomialis不動桿菌均為碳青霉烯類抗生素敏感。而鮑曼不動桿菌中僅有一株為碳青霉烯類抗生素敏感，其余均為

13、耐藥。同時，鮑曼不動桿菌對第三代和四代頭孢菌素、含β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑、氨基糖苷類、米諾環(huán)素和環(huán)丙沙星的耐藥性均要高于pittii不動桿菌和nosocomialis不動桿菌。
　　 Southern雜交結(jié)果顯示，13株不動桿菌中blaOXA-58基因均定位于質(zhì)粒上，質(zhì)粒大小范圍在52kb～305kb之間。除了305kb的質(zhì)粒外，其余質(zhì)粒均可通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移到碳青霉烯類抗生素敏感的鮑曼不動桿菌受體菌中。應(yīng)用AB-PBRT分型

14、法發(fā)現(xiàn)，這些質(zhì)粒不屬于已知的質(zhì)粒復(fù)制子分型。確認(rèn)了2株pittii不動桿菌，3株nosocomialis不動桿菌和2株鮑曼不動桿菌中攜帶blaOXA-58基因的質(zhì)粒屬于一種新的質(zhì)粒復(fù)制子分型，命名為Aci10。
　　 對blaOXA-58基因的周圍序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在blaOXA-58基因的上游存在類似插入序列(Insertionsequence，IS)ISAba3的ISAba3-like結(jié)構(gòu)。部分菌株的ISAba3-like結(jié)

15、構(gòu)被IS6家族的插入序列打斷，形成IS6family-△ISAba3-like-blaOXA-58的特殊結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)僅出現(xiàn)在7株碳青霉烯類抗生素耐藥的鮑曼不動桿菌和1株碳青霉烯類抗生素敏感的nosocomialis不動桿菌中，且具有此結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入鮑曼不動桿菌受體菌后介導(dǎo)了受體菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥或中介。其余碳青霉類抗生素敏感的不動桿菌中blaOXA-58基因的上游的ISAba3-like結(jié)構(gòu)未被其他IS序列打斷。啟動子

16、分析發(fā)現(xiàn)，IS6family-△ISAba3-like結(jié)構(gòu)為下游blaOXA-58的表達(dá)提供了強(qiáng)啟動子，在介導(dǎo)碳青霉烯類抗生素耐藥中起了重要作用。部分菌株blaOXA-58基因的周圍序列中發(fā)現(xiàn)了重組位點序列，提示blaOXA-58基因的轉(zhuǎn)移可能和重組事件有關(guān)。ST91型鮑曼不動桿菌blaOXA-58基因的下游同時發(fā)現(xiàn)了攜帶氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶基因aphA6的復(fù)合轉(zhuǎn)座子TnaphA6。aphA6隨blaOXA-58基因進(jìn)行傳播使受體菌同時

17、獲得對碳青霉烯類抗生素和氨基糖苷類抗生素的耐藥能力。
　　 本研究第二部分發(fā)現(xiàn)blaOXA-58基因可存在于pittii不動桿菌、nosocomialis不動桿菌和鮑曼不動桿菌中，且均定位于質(zhì)粒上，可以通過電轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)移到受體菌中。pittii不動桿菌、nosocomialis不動桿菌和部分鮑曼不動桿菌中攜帶blaOXA-58基因的質(zhì)粒具有相同的質(zhì)粒復(fù)制子分型，提示質(zhì)粒在不動桿菌間的傳播也是造成鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐