金葡菌Efb蛋白通過抑制血小板聚集引發(fā)感染的機(jī)制研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcal aureus)是一種廣泛存在的革蘭氏陽性致病菌，能夠引起皮膚黏膜、多種組織器官的化膿性炎癥，也可由此導(dǎo)致危及生命的敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、腦膜炎等；此外，尚可引起異物相關(guān)感染、尿路感染、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎、腸炎等。
　　 血小板作為血液的重要組成成分，參與了機(jī)體的凝血，傷口愈合以及炎癥反應(yīng)等過程。血小板在激活后能夠直接吞噬細(xì)菌，也可以分泌抗菌肽來清除細(xì)菌。更重要的是，活化后的血小板通過分

2、泌多種細(xì)胞因子及趨化因子招募天然免疫系統(tǒng)的其他組分如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞共同抵抗感染。血小板的活化、聚集與細(xì)菌性心內(nèi)膜炎密切相關(guān)。
　　 金葡菌能夠表達(dá)兩類與血小板相互作用的分子，一類是促進(jìn)血小板聚集和活化的功能分子，另一類是對(duì)血小板聚集過程發(fā)揮抑制功能的分子。金葡菌為何存在兩種功能相反的分子以及血小板與金葡菌感染之間的關(guān)系尚不清楚。
　　 Efb(extracellular fibrinogen-binding pro

3、tein)是金葡菌中唯一一個(gè)能夠抑制血小板聚集的蛋白，其全長(zhǎng)131aa，為一雙功能蛋白，其位于N端的2個(gè)重復(fù)片段區(qū)能夠與纖維蛋白原(Fibrinogen)α鏈結(jié)合抑制血小板的聚集；而其C端能夠與C3(d)結(jié)合抑制補(bǔ)體通路的激活。efb突變體菌株對(duì)動(dòng)物感染能力下降。
　　 本研究以Efb蛋白作為研究對(duì)象，通過構(gòu)建efb突變體菌株及表達(dá)制備了功能性蛋白和抗體，旨在探討Efb蛋白的抑制血小板聚集功能與金葡菌感染的關(guān)系，為防治金葡菌引發(fā)

4、感染提供了一個(gè)新的視點(diǎn)。本論文的主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1、金葡菌株efb突變體制備及Efb蛋白的生物學(xué)功能研究。通過基因同源重組的方法在金葡菌8325-4菌株中構(gòu)建efb突變體。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，efb突變體菌株其毒力及致死率顯著下降。體外表達(dá)了全長(zhǎng)Efb蛋白，N端(EfbN)和C端(EfbC)，并對(duì)其進(jìn)行了功能檢測(cè)。補(bǔ)體激活及競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)顯示EfbC能夠抑制補(bǔ)體激活的經(jīng)典和替代途徑；進(jìn)一步的研究表明，EfbN能夠

5、抑制血小板聚集且與纖維蛋白原結(jié)合，提示Efb(N)通過與Fg結(jié)合抑制血小板聚集。我們制備的Efb特異多克隆抗體能夠阻斷Efb的補(bǔ)體抑制功能。
　　 2、Efb蛋白抑制血小板聚集引發(fā)金葡菌感染的機(jī)制研究。金葡菌全血存活實(shí)驗(yàn)顯示血小板存在與否及聚集狀態(tài)對(duì)于金葡菌的存活密切相關(guān)。蛋白表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果顯示Efb在金葡菌生長(zhǎng)的早期表達(dá)。對(duì)動(dòng)物急性腹膜炎模型提前通過給予蛋白Efb(N)或者藥物抑制血小板聚集能夠加劇金葡菌的感染。動(dòng)物血象的動(dòng)態(tài)

6、監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示相對(duì)于對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物體內(nèi)的血小板數(shù)目(實(shí)驗(yàn)組高)及中性粒細(xì)胞比率(實(shí)驗(yàn)組低)均存在顯著差異；實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的TNFα水平明顯上升；實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腹腔內(nèi)的細(xì)菌數(shù)目顯著高于對(duì)照組；半定量RT-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組體內(nèi)細(xì)菌agr系統(tǒng)主要毒力基因的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。以上結(jié)果顯示EfbN以及血小板活化阻斷藥物可以通過抑制血小板的聚集，提高金葡菌在體內(nèi)的存活，加劇其對(duì)機(jī)體的感染。
　　 綜上所述，本研究在闡明Efb蛋白的生物學(xué)功