HCMV在結締組織病相關性間質性肺病發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　間質性肺病進行性肺纖維化是導致結締組織病患者死亡的主要原因之一。迄今為止,自身免疫疾病患者發(fā)生間質性肺炎/肺纖維化的病因仍不清楚。糖皮質激素及免疫抑制劑是目前抗纖維化治療的主要手段，但對多數(shù)患者并不顯示明確的療效。闡明間質性肺纖維化在自身免疫疾病患者中的發(fā)病誘因及可能依賴的機制，是發(fā)展有效治療方法與藥物的必要基礎。
　　大量的研究提示:病毒感染可能作為一種潛在的觸發(fā)機制，在人類腫瘤與纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展

2、中起重要作用。皰疹病毒家族中的Epstein-Barr virus(EBV)和human herpesvirus6(HHV-6)已經(jīng)在類風濕關節(jié)炎患者外周血檢出，研究認為它們可能作為佐劑非特異刺激固有免疫反應，與自身免疫疾病發(fā)生有關。在皰疹病毒家族成員HCMV DNA血清陽性的健康成人，其外周血免疫亞群呈現(xiàn)激活狀態(tài)，盡管HCMV感染僅在免疫缺陷或功能抑制者可引起致死性間質性肺炎。由此可見，誘導持續(xù)性固有免疫炎癥反應是宿主感染皰疹病毒的一

3、個關鍵事件。尤其重要的是近來研究發(fā)現(xiàn)：局部與系統(tǒng)的免疫激活和損傷的免疫耐受也與間質性肺疾病特發(fā)性肺間質纖維化（IPF）關聯(lián)。綜合上述我們推測：皰疹病毒感染可能是自身免疫紊亂狀態(tài)下發(fā)生肺間質炎癥及進行性纖維化的重要觸發(fā)因素。因此，在本研究中，我們以CTD-ILD患者為研究對象，調(diào)查分析主要的三種皰疹病毒（EBV，HCMV和HSV）的感染情況，動態(tài)觀察比較CTD-ILD患者免疫亞群與細胞因子表達譜改變及肺部高分辨CT和肺功能變化，旨在于闡明

4、是否這些病毒感染在結締組織病患者肺間質纖維化發(fā)病中作為主要的觸發(fā)因素之一。
　　研究內(nèi)容和方法：
　　第一部分皰疹病毒（HCMV、EBV和HSV）在結締組織病相關性間質性肺病的感染情況及其與患者肺功能和肺間質病理改變的關系
　　收集62例CTD-ILD患者、16例RA患者以及33例健康體檢者血漿和單個核細胞，以及14例來源于上述62例CTD-ILD患者經(jīng)纖支鏡活檢的肺組織標本，用Real-time PCR的方法檢測三種

5、皰疹病毒（HCMV、EBV和HSV）感染情況。CTD-ILD患者行肺功能測試(FVC％和DLCO%)和胸部高分辨率CT掃描。
　　第二部分 HCMV陽性檢出結締組織病相關性間質性肺病患者外周血免疫亞群狀態(tài)、炎癥細胞因子表達譜及其肺間質病變預后分析
　　收集29例未用免疫抑制劑治療的CTD-ILD患者的外周血，進行流式細胞學檢測，觀察 CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD3+CD56+，CD4+CD25+Foxp3+細胞亞

6、群比例變化；并用液相芯片和Elisa方法檢測血漿中細胞因子IL-6，TNF-α，IFN-γ， TGF-β和IL-10的水平。對14例纖支鏡活檢的肺組織標本進行HE染色和CD3免疫組化染色，觀察患者肺組織病理表現(xiàn)和淋巴細胞浸潤情況。檢測50例HCMV陽性CTD-ILD患者經(jīng)常規(guī)藥物治療六個月后HCMV清除情況，分析HCMV持續(xù)陽性對肺功能和影像表現(xiàn)等預后的影響。
　　第三部分體外HCMV感染外周血單個核細胞對促纖維化細胞因子表達的影

7、響，及其與CTD-ILD患者的比較
　　在體外培養(yǎng)CTD-ILD患者單個核細胞和肺成纖維細胞，檢測上清液中細胞因子IL-6，IL-17，IL-10，TGF-β和VACM-1的水平，并用免疫組化方法檢測肺組織中α-SMA的表達。用HCMV AD169感染正常人PBMC，分別用Real-time PCR和液相芯片的方法檢測HCMV感染對PBMC分泌的細胞因子IL-6，TGF-β的表達及上清液中IL-6，TGF-β，IL-10水平的影響

8、。
　　結果
　　第一部分 HCMV在具有間質性肺病的結締組織病患者高頻檢出并影響間質性肺病的發(fā)展
　　CTD-ILD患者HCMV DNA檢出率明顯高于健康對照組（41.94%vs.6.06%,P<0.001），而且，HCMV感染率與應用免疫抑制劑無關。不同類型結締組織病相關性間質性肺病的感染率分別為 DM-ILD42.11%、RA-ILD50.00%、SSc-ILD37.50%、SS-ILD33.33%和 AIF-I

9、LD42.86%，各組間無明顯差異，進一步比較RA-ILD與RA患者HCMV感染情況發(fā)現(xiàn)，合并肺間質病變的RA患者HCMV感染率明顯高于無肺部病變的RA患者（50.00%vs.10.53%, P=0.022）。HCMV陽性CTD-ILD患者肺功能參數(shù)（FVC%，DLCO%）和肺部影像學表現(xiàn)（HRCT）均比HCMV陰性患者差。
　　第二部分 HCMV陽性結締組織病相關性間質性肺病患者表現(xiàn)顯著免疫亞群異常及促纖維化細胞因子高表達，與肺

10、病變和肺功能下降程度關聯(lián)且影響預后
　　在CTD-ILD患者肺組織中有大量炎癥細胞的浸潤，以CD3+的T淋巴細胞為主。外周血流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)，與HCMV陰性的CTD-ILD患者相比較，HCMV陽性的CTD-ILD患者CD3+CD8+T細胞比例明顯高于健康對照組（30.88±4.85%vs.25.93±8.97%, P<0.001），而 CD4+與 CD8+比率則明顯低于健康對照組（1.07±0.51 vs.1.59±0.98, P

11、=0.001）。而且HCMV陽性CTD-ILD患者與對照組相比，Treg細胞明顯下降（3.94±1.18% vs.5.68±1.26%，P=0.001），而 HCMV陰性患者與對照組相比，Treg的下降趨勢卻不顯著。不論是否有HCMV感染， CTD-ILD患者CD3+CD56+NKT細胞均明顯高于對照組。細胞因子檢測顯示， HCMV陽性的CTD-ILD患者促炎/促纖維化的細胞因子（例如：IL-6, TGF-β1和IL-10），特別是升高

12、的IL-6和 IL-10水平和減少的TGF-β1/IL-6比率均比HCMV陰性的CTD-ILD患者和對照組明顯。50例HCMV陽性CTD-ILD患者經(jīng)常規(guī)藥物治療六個月后，有30例患者HCMV轉為陰性，與治療前相比，肺功能（FVC%和DLCO%）明顯改善，HRCT總評分下降，同時IL-6的含量明顯減少（P=0.002， P=0.008，P=0.005和P=0.026）。
　　第三部分體外HCMV感染外周血單個核細胞誘導了促纖維化細

13、胞因子的表達，與在CTD-ILD的發(fā)現(xiàn)一致
　　檢測CTD-ILD患者單個核細胞和肺成纖維細胞的上清液中細胞因子發(fā)現(xiàn)，患者PBMC分泌的IL-6，IL-17，IL-10水平明顯高于正常對照組（2650.17±510.88 vs.1867.58±347.77， p<0.01;164.55±82.94 vs.17.58±6.29,p<0.01;51.58±25.16 vs.3.61±1.55,p<0.01）；患者肺成纖維細胞分泌的 I

14、L-6和VACM-1的水平高于對照組，而TGF-β水平卻低于對照組（P<0.05）。免疫組化顯示CTD-ILD患者α-SMA和膠原染色明顯增強。HCMV AD169感染正常人PBMC后細胞因子IL-6的表達增多，上清液中分泌的IL-6和IL-10含量明顯升高。
　　結論
　　1.巨細胞病毒（HCMV）在具有ILD的CTD患者高頻檢出，HCMV感染與結締組織病患者發(fā)生間質性肺炎/纖維化密切相關。
　　2.HCMV感染可能

15、通過促進炎癥/纖維化細胞因子的釋放，特別是產(chǎn)生高水平IL-6，干擾Treg分化，介導了殺傷性免疫細胞亞群和免疫耐受亞群的紊亂狀態(tài)，導致持續(xù)免疫炎癥反應，誘導肺損傷及纖維化修復。
　　3.HCMV持續(xù)陽性是CTD-ILD患者對藥物治療不反應以及間質性肺病預后不良的重要原因。
　　4.HCMV能夠感染外周血單個核細胞誘導細胞因子 IL-6，IL-10，TGF-β合成釋放，與發(fā)生進行性肺纖維化的CTD-ILD患者外周血單個核細胞的