蘿卜硫素對(duì)2型糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞退行性變的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病性耳聾是一種以高頻為主，外毛細(xì)胞散在缺失為特征的感音神經(jīng)性耳聾。長(zhǎng)期高血糖及其代謝產(chǎn)物導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可激活多種凋亡信號(hào)通路造成耳蝸細(xì)胞的不可逆性損害，是感音神經(jīng)性耳聾發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。耳蝸的獨(dú)特結(jié)構(gòu)及維持聽功能正常時(shí)易受到自由基的氧化損傷。大量聽力學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)糖尿病患者毛細(xì)胞出現(xiàn)退行性變。硫氧還蛋白(th ioredoxin，Trx)是體內(nèi)最主要的抗氧化劑之一，在減少細(xì)胞凋亡和抗氧化方面起著關(guān)鍵的作用。蘿卜硫素(

2、SF)是廣泛存在于西蘭花等十字花科蔬菜及萊菔子等食/藥用植物中的抗氧化誘導(dǎo)劑。NF-E2-相關(guān)因子2(Nrf2)是核心轉(zhuǎn)錄蛋白，能結(jié)合ARE區(qū)域后調(diào)節(jié)Ⅱ相代謝酶基因的轉(zhuǎn)錄。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是生物體內(nèi)關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)之一，參與介導(dǎo)多種細(xì)胞生物過程。研究證實(shí)SF能通過上調(diào)Trx的表達(dá)對(duì)Tub小鼠耳蝸毛細(xì)胞的退變起保護(hù)作用。
　　本課題通過建立2型糖尿病小鼠模型，探討蘿卜硫素(SF)保護(hù)糖尿病之高糖所致的耳蝸毛細(xì)胞退行性

3、變性的保護(hù)作用機(jī)制，以期為臨床預(yù)防和治療糖尿病性耳聾提供新理論依據(jù)及治療指導(dǎo)方案。
　　方法:
　　1.建立2型糖尿病動(dòng)物模型
　　首先根據(jù)國(guó)際公認(rèn)的建模標(biāo)準(zhǔn)建立2型糖尿病小鼠模型，以隨機(jī)空腹血糖＞7.8mmol/L及出現(xiàn)胰島素抵抗為建模成功。將Balb/c小鼠分為2型糖尿病組(T2DM)與正常組(control)。繼之以不同劑量SF(0.5mg/kg，1mg/kg，2mg/kg)及同一劑量的SF不同給藥時(shí)間(5d，1

4、0d，15d)分別處理T2DM組小鼠后，檢測(cè)T2DM組和Control組小鼠耳蝸中Trx基因和蛋白的表達(dá)水平，以確定最佳給藥劑量和有效用藥時(shí)間。最后用SF和Trx的抑制劑(PX-12)對(duì)Control組和T2DM兩組進(jìn)行相同處理，分為對(duì)照組、治療組(SF)、和實(shí)驗(yàn)組(SF+PX-12)。
　　2.我們通過耳蝸毛細(xì)胞琥珀酸脫氫酶(succinic dehydrogenase，SDH)染色，進(jìn)行耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)以及耳蝸切片HE染色對(duì)耳蝸

5、組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察分析;采用耳蝸石蠟切片免疫熒光組織化學(xué)的方法檢測(cè)Trx與ASK1在耳蝸組織的定位及表達(dá)情況;采用Real-time PCR檢測(cè)耳蝸組織中Trx及Txnip基因水平，用Western blot方法檢測(cè)小鼠耳蝸組織中Trx，Nrf2，p-Erk，及細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白激酶ASK1的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.SF對(duì)T2DM組小鼠耳蝸組織中Trx基因和蛋白水平的影響。
　　以不同劑量的SF(0.5mg/

6、kg,1 mg/kg，2mg/kg)處理T2DM組小鼠后，Western blot檢測(cè)Trx蛋白水平結(jié)果顯示，SF各劑量處理組與T2DM對(duì)照組比較Trx的表達(dá)均有不同程度的升高(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.05)。其中以1.0mg/kg劑量組最為顯著。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果與Western blot檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)一致，各劑量組耳蝸組織中Trx基因表達(dá)較T2DM對(duì)照組均有所上調(diào)，以1mg/kg劑量組最為顯著(p＜0.01

7、)。選用SF1 mg/kg劑量以不同時(shí)間(5d，10d，15d)處理T2DM組小鼠后，Real-timePCR檢測(cè)與Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T2DM組小鼠耳蝸中Trx的表達(dá)水平與用藥時(shí)間成正相關(guān)，其中以15天效果最佳(p＜0.01)。
　　2.SF與PX-12對(duì)T2DM小鼠耳蝸毛細(xì)胞退行性變的作用及機(jī)制。
　　2.1 SF及PX-12對(duì)T2DM小鼠耳蝸毛細(xì)胞退行性變的影響
　　采用耳蝸毛細(xì)胞琥珀酸脫氫酶(

8、succinic dehydrogenase，SDH)染色法，小鼠耳蝸頂回至底回以相等距離(200un)計(jì)數(shù)毛細(xì)胞缺失數(shù)，SDH染色顯色細(xì)胞為活細(xì)胞。觀察可見各T2DM組，距頂回70％處外毛細(xì)胞排列不規(guī)則，開始明顯缺失。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，各T2DM組與正常組比較外毛細(xì)胞數(shù)均有不同程度的減少而內(nèi)毛細(xì)胞數(shù)減少輕微。其中T2DM對(duì)照組與正常組比較外毛細(xì)胞數(shù)顯著減少(p＜0.001，n=3)，內(nèi)毛細(xì)胞均數(shù)亦有所減少(p＜0.05，n=3)。T2DM

9、組中單純給與SF組與T2DM對(duì)照組比較外毛細(xì)胞均數(shù)有明顯增加(p＜0.001，n=3)，內(nèi)毛細(xì)胞數(shù)有所增加(p＜0.05，n=3)。T2DM組中SF和PX-12聯(lián)合作用組與單純給與SF組比較外毛細(xì)胞數(shù)減少(p＜0.01，n=3)，內(nèi)毛細(xì)胞數(shù)也有所減少(p＜0.05，n=3)。從耳蝸組織HE染色切片觀察毛細(xì)胞缺失趨勢(shì)與毛細(xì)胞SDH染色計(jì)數(shù)結(jié)果一致。
　　2.2 熒光免疫組化法觀察SF與PX-12對(duì)T2DM小鼠耳蝸組織中Trx和ASK

10、1表達(dá)的影響
　　熒光免疫組化結(jié)果分析顯示，Trx與ASK1的表達(dá)主要位于小鼠耳蝸毛細(xì)胞中，T2DM組小鼠與正常組小鼠比較耳蝸毛細(xì)胞中Trx表達(dá)明顯減弱，而ASK1的表達(dá)明顯增強(qiáng)。T2DM組中單純給與SF組與T2DM對(duì)照組比較耳蝸毛細(xì)胞中Trx表達(dá)明顯增強(qiáng)，ASK1的表達(dá)則明顯減弱。T2DM組中SF和PX-12聯(lián)合作用組與單純給與SF組比較耳蝸毛細(xì)胞中Trx的表達(dá)有所減弱，ASK1的表達(dá)有所增強(qiáng)。
　　2.3 SF與PX-1

11、2對(duì)T2DM小鼠耳蝸中Trx、Txnip與ASK1，Nrf2與P-Erk表達(dá)的影響
　　用Real-time PCR的方法檢測(cè)各組耳蝸組織中的Trx和Txnip的基因表達(dá)水平，檢測(cè)結(jié)果分析顯示，與正常對(duì)照組比較，T2DM組小鼠耳蝸組織中的Trx基因表達(dá)明顯下調(diào)(p＜0.01，n=3)，Txnip基因表達(dá)明顯上調(diào)(p＜0.01，n=3)。單純給與SF處理的正常組小鼠與正常對(duì)照組比較其耳蝸中的Trx基因表達(dá)有所上調(diào)(p＜0.05n=3

12、)，Txnip的表達(dá)有所下調(diào)(p＜0.05，n=3)。SF與PX-12聯(lián)合處理的正常組小鼠與單純給與SF處理的正常組小鼠比較Trx基因表達(dá)有所下調(diào)(p＜0.05，n=3)，Txnip的表達(dá)有所上調(diào)(p＜0.05，n=3)。單純給與SF處理的T2DM組小鼠與T2DM對(duì)照組比較其耳蝸組織中的Trx基因表達(dá)有所上調(diào)(p＜0.05，n=3)，Txnip的表達(dá)有所下調(diào)(p＜0.05，n=3)。SF與PX-12聯(lián)合處理的T2DM組小鼠與單純給與SF

13、處理的T2DM組小鼠比較Trx基因表達(dá)有所下調(diào)(p＜0.05，n=3)，Txnip的表達(dá)有所上調(diào)(p＜0.05，n=3)。
　　Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，T2DM組小鼠耳蝸組織中的Trx、Nrf2和p-Erk的蛋白表達(dá)水平均有明顯下調(diào)(p＜0.01，p＜0.01，p＜0.05; n=3)，ASK1的表達(dá)明顯上調(diào)(p＜0.01，n=3)。單純給與SF處理的正常組小鼠與正常對(duì)照組比較其耳蝸組織中的Trx、

14、Nrf2和p-Erk蛋白表達(dá)均有上調(diào)(p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05; n=3)，ASK1的表達(dá)有所下調(diào)(p＜0.01，n=3)。SF與PX-12聯(lián)合處理的正常組小鼠與單純給與SF處理的正常組小鼠比較Trx、Nrf2和p-Erk表達(dá)有不同程度的下調(diào)(p＜0.01，p＜0.05，p＜0.05;n=3)，ASK1的表達(dá)有所上調(diào)(p＜0.05，n=3)。單純給與SF處理的T2DM組小鼠與T2DM對(duì)照組比較其耳蝸中的Trx、Nrf2和

15、p-Erk表達(dá)有不同程度的上調(diào)(p＜0.05，p＜0.05，p＜0.01;n=3)，ASK1的表達(dá)有所下調(diào)(p＜0.05，n=3)。SF與PX-12聯(lián)合處理的T2DM組小鼠與單純給與SF處理的T2DM組小鼠比較Trx、Nrf2和p-Erk表達(dá)有不同程度的下調(diào)(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.05; n=3)，ASK1的表達(dá)有所上調(diào)(p＜0.05，n=3)。說明SF通過作用于p-Erk/Nrf2抗氧化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)Trx的表達(dá)，抑制

16、ASK1引起的凋亡信號(hào)通路的激活，從而對(duì)糖尿病耳蝸毛細(xì)胞的退變起保護(hù)作用。
　　結(jié)論:
　　1.糖尿病小鼠耳蝸底回外毛細(xì)胞丟失顯著，毛細(xì)胞中Trx表達(dá)下調(diào)，而Txnip、ASK1表達(dá)明顯上調(diào)。
　　2.SF能夠有效上調(diào)耳蝸毛細(xì)胞的Trx表達(dá)從而抑制Txnip的活性以及ASK1介導(dǎo)的下游凋亡通路的激活，對(duì)糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞的退變起到保護(hù)作用。
　　3.p-Erk/Nrf2抗氧化酶鏈與SF介導(dǎo)Trx表達(dá)的上調(diào)有關(guān)。