BMP信號(hào)通路介導(dǎo)酒精致H9c2心肌細(xì)胞組蛋白高乙酰化上調(diào)心臟核心轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的研究.pdf

1、目的：采用Bone morphogenetic protein（骨形態(tài)形成蛋白，BMP）信號(hào)通路的特異性抑制劑dorsomorphin（DM）阻斷其傳導(dǎo)，以證實(shí)BMP信號(hào)通路介導(dǎo)酒精致組蛋白高乙酰化上調(diào)心臟核心轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的科學(xué)假說。
　　方法：
　?。?）不同濃度酒精濃度（0mM、10mM、50mM、100mM、200mM、500mM和1000mM）處理H9c2細(xì)胞，36h后采用MTT檢測(cè)各干預(yù)組H9c2細(xì)胞存活率，篩選最

2、適酒精干預(yù)濃度。
　?。?）酒精干預(yù)細(xì)胞36h后采用Real-Time qRT-PCR方法檢測(cè)BMPs各亞型mRNA的表達(dá)水平；加入不同DM濃度（0μM、1μM、2.5μM、5μM、10μM和20μM）阻斷酒精作用，36h后采用Real-Time qRT-PCR方法檢測(cè)BMPs通路下游靶基因GATA4 mRNA表達(dá)水平，篩查出最適DM濃度。
　?。?）酒精和/或DM處理細(xì)胞36h后，應(yīng)用Real-Time qRT-PCR技術(shù)

3、檢測(cè)心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2C、GATA4、Nkx2.5和Tbx5的表達(dá)，及Smad4 mRNA的表達(dá)水平；采用Western-blotting技術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞組蛋白H3總乙?；胶托呐K發(fā)育相關(guān)基因Cx43表達(dá)水平；ChIP-Real-Time qPCR技術(shù)檢測(cè)核心轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3乙?；?。
　　結(jié)果：
　?。?）10mM、50mM、100mM酒精干預(yù)36h后H9c2細(xì)胞生存率與對(duì)照組比較沒有變化（P＞0

4、.05），200mM、500mM和1000mM酒精使細(xì)胞生存率降低25.4%、37.0%和75.0%（P＜0.05）。
　　（2）100mM酒精干預(yù)36h后，H9c2心肌細(xì)胞BMP2（1.60±0.14）、BMP4（1.27±0.08）、BMP6（1.44±0.25）、BMP7（1.59±0.06）mRNA相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組升高（P＜0.05）；BMP5（1.14±0.08）、BMP10（1.05±0.09）mRNA相對(duì)表達(dá)量較

5、對(duì)照組有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　?。?）100mM酒精和不同濃度DM干預(yù)后，GATA4 mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)出先降低后上升的趨勢(shì)，且在DM濃度為5μM時(shí)達(dá)到最低。
　?。?）100mM酒精可引起MEF2C（1.42±0.27）、GATA4（1.50±0.15）、Nkx2.5（1.41±0.18）和Smad4（1.78±0.15）mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）；加入5μM DM后能降至正常水平（P

6、＞0.05）；5μM DM可使MEF2C mRNA表達(dá)水平上升1.2倍（P＜0.05）；100mM酒精使Cx43蛋白表達(dá)水平升高2.7倍（P＜0.05）；加入5μM DM后能降至正常水平（P＞0.05）；100mM酒精、5μM DM對(duì)TBX5 mRNA表達(dá)（0.98±0.08）、（0.95±0.23）無明顯影響（P＞0.05）。
　　（5）100mM酒精可使組蛋白H3總乙?；缴仙?.4倍（P＜0.05），加入5μM DM后降至

7、對(duì)照組水平（P＞0.05）。
　　（6）100mM酒精能使MEF2C（1.56±0.24）、GATA4（2.04±0.69）和Nkx2.5（1.50±0.17）啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白 H3乙酰化水平升高（P＜0.05），加入5μM DM后MEF2C和GATA4啟動(dòng)子區(qū)域乙?；较陆抵琳＃≒＞0.05），Nkx2.5啟動(dòng)子區(qū)域乙酰化水平下調(diào)（1.25±0.16），但未降至正常（P＜0.05）。100mM酒精、5μM DM未對(duì)TBX5