胃組織紅桂木凝集素受體表達的研究.pdf

1、目的:
　　目前惡性腫瘤是疾病死亡的首位原因。細胞癌變、浸潤和轉(zhuǎn)移往往表現(xiàn)為細胞膜上糖蛋白或糖脂的改變，根據(jù)凝集素對糖及其綴合物高度專一識別的特性，可利用外源植物凝集素作為探針在分子水平上研究細胞惡變過程中膜結(jié)構(gòu)的改變。本課題首先將紅桂木凝集素進行辣根過氧化物酶或異硫氰酸熒光素標記，然后進行凝集素組化染色，觀察胃癌組織和胃正常組織中紅桂木凝集素受體的表達差異，為探索腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制以及紅桂木凝集素在腫瘤診斷中的應(yīng)用提供理論和實驗

2、依據(jù)。
　　方法:
　　一、分離純化紅桂木凝集素:參照本實驗室常規(guī)分離、純化紅桂木凝集素的方法[1,2]，將紅桂木種子研磨，硫酸鹽分級沉淀法鹽析蛋白，采用Gal-Sepharose6B親和層析純化蛋白，透析、超濾、凍干、儲存。紅細胞凝集實驗檢測紅桂木凝集素活性。
　　二、ALL-FITC和ALL-HRP的制備
　　1.ALL-FITC的制備:
　　(1)透析法制備ALL-FITC:將紅桂木凝集素凍干粉配制成

3、溶液，測定濃度，加入FITC，將溶液充分混勻，透析，測定偶聯(lián)物F/P值。
　　(2)固化法制備ALL-FITC:先將紅桂木凝集素與Sepharose4B固相吸附，再將FITC溶液滴入凝膠柱內(nèi)，用Gal-PBS洗脫ALL-FITC，測定該偶聯(lián)物F/P值。
　　(3)比較兩種方法的F/P值。
　　2.ALL-HRP的制備:
　　ALL-HRP的制備:采用高碘酸鹽氧化法制備，將HRP在高碘酸鈉溶液中對乙酸緩沖液透析，再

4、加入已測定好濃度的紅桂木凝集素溶液，透析后避光保存。
　　三、胃組織中紅桂木凝集素受體的表達分析
　　1.病例收集:收集32例胃腺癌癌變組織切片和25例胃正常組織切片。
　　2.ALL-FITC染色:石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，將ALL-FITC覆蓋于組織上，避光孵育，復(fù)染DAPI，利用熒光倒置顯微鏡觀察紅桂木凝集素受體表達情況。
　　3.ALL-HRP染色:石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，將ALL-HRP覆蓋于組織上，避光孵育

5、，再用蘇木精復(fù)染，DAB試劑盒顯色，在顯微鏡下觀察紅桂木凝集素受體表達情況。
　　四、ALL-Sepharose6B的制備:
　　將活化好的Sepharose6B與ALL親和吸附，封閉Sepharose6B其余的活性基團，測定ALL-Sepharose6B的凝血活性。
　　結(jié)果:
　　一、從紅桂木種子中分離純化得到紅桂木凝集素，經(jīng)紅細胞凝集實驗檢測，凝集活力為29-211。
　　二、透析法制備ALL-FIT

6、C的F/P值為0.758，固化法的F/P值為1.02，兩種方法所制備的ALL-FITC用于石蠟切片染色均得到較好的效果。
　　三、胃癌組織紅桂木凝集素受體的表達觀察
　　1.ALL-FITC染色:
　　正常胃組織經(jīng)染色后在熒光顯微鏡下可看到較微弱的綠色熒光，胃腺癌切片在鏡下可看見明亮的綠色熒光，藍色細胞核分布在綠色熒光中，說明紅桂木凝集素受體主要分布在癌細胞的胞漿內(nèi)。胃正常組織和胃腺癌組織均有紅桂木凝集素受體表達，胃腺

7、癌組織陽性率為68.8％，胃正常組織陽性率為24％，兩組受體表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，表明胃腺癌組織紅桂木凝集素受體表達明顯多于正常胃組織的。
　　2.ALL-HRP染色:
　　鏡下觀察胃正常組織輕微著染，胃腺癌組織則著染為棕褐色，受體主要分布在癌細胞的胞漿內(nèi)，有些受體主要分布在癌細胞的一側(cè)胞漿中，有的則散布在整個胞漿內(nèi)，細胞核未見著染。胃正常組織和胃腺癌組織均有紅桂木凝集素受體表達，胃腺癌組織陽性率為75％，

8、胃正常組織陽性率為16％，兩組受體表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000.)，表明胃腺癌組織紅桂木凝集素受體表達明顯多于正常胃組織的。
　　四、偶聯(lián)Sepharose6B的ALL可使紅細胞凝集，說明Sepharose6B已成功偶聯(lián)ALL。
　　結(jié)論:
　　一、固化法制備ALL-FITC優(yōu)于透析法。
　　二、本實驗制備的ALL-FITC和ALL-HRP均可用于組織細胞紅桂木凝集素受體的表達分析。
　　三、紅桂木