糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的典型農(nóng)藥和金屬的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的體外評(píng)價(jià).pdf

1、農(nóng)藥和金屬是環(huán)境中兩類重要的污染物。全球每年大約有100-250萬(wàn)噸的農(nóng)藥用于農(nóng)業(yè)、住宅和公共衛(wèi)生等方面，大量文獻(xiàn)表明其母體化合物或代謝產(chǎn)物在環(huán)境中廣泛存在。由于礦物開采加工和電子垃圾的廢棄，金屬污染也越來(lái)越受到人們的重視。已有多項(xiàng)研究證明許多農(nóng)藥和金屬是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)，可以通過(guò)模擬或拮抗生物體內(nèi)源激素，干擾激素受體的正常功能。皮質(zhì)激素包括糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素

2、，通過(guò)與其特異性受體[即糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)]結(jié)合并轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控下游基因表達(dá)，從而發(fā)揮生理功能。這兩種皮質(zhì)激素受體在大腦、腎、肝、心血管、結(jié)腸等多種組織和器官中表達(dá)，起著不可或缺的作用。然而，目前關(guān)于EDCs與GR、MR之間相互作用的研究仍然十分有限。因此建立快速篩選類/抗皮質(zhì)激素EDCs的檢測(cè)方法和評(píng)價(jià)體系，

3、為EDCs的環(huán)境安全和健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)保障人民健康與安全有重大現(xiàn)實(shí)意義。本論文主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　(1)使用雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、激素響應(yīng)基因?qū)嶒?yàn)，檢測(cè)34種常用農(nóng)藥及農(nóng)藥代謝產(chǎn)物對(duì)GR的干擾作用，并利用分子對(duì)接對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探索。所測(cè)34種化合物對(duì)GR均不存在的顯著的激動(dòng)作用。而其中12種化合物，包括5種擬除蟲菊酯(氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、高效氯氟氰菊酯、3-苯氧基苯甲醇(3-PBA)和芐呋菊酯）、4種有機(jī)氯（o,p

4、'-DDT、p,p'-DDT、p,p'-DDE和甲氧滴滴涕）、氨基甲酸酯殺蟲劑乙硫苯威、三嗪除草劑莠去津和殺真菌劑甲苯氟磺胺顯著抑制了GR轉(zhuǎn)錄活性。芐呋菊酯、乙硫苯威、聯(lián)苯菊酯、高效氧氟氰菊酯、氯氰菊酯、p,p'-DDT、o,p'-DDT、甲氧滴滴涕和甲苯氟磺胺，表現(xiàn)較強(qiáng)的GR拮抗活性，其化合物抑制糖皮質(zhì)激素作用的20％的相對(duì)濃度(RIC20)低于10-6M。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4種有機(jī)氯農(nóng)藥、聯(lián)苯菊酯和3-PBA抑制了大鼠肝癌細(xì)胞H4ⅡE

5、中糖皮質(zhì)激素響應(yīng)基因烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(phosphoenol pyruvate carboxykinase)的表達(dá)，o，p'-DDT和甲氧滴滴涕還可抑制精氨酸酶(arginase)和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（tyrosine aminotransferase，TAT）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。氯氰菊酯和甲苯氟磺胺也可抑制TAT的表達(dá)。在小鼠免疫細(xì)胞J774A.1中，高效氯氟氰菊酯、芐呋菊酯、3-PBA、o,p'-DDT、p,p'-DDT、p,p'-DDE

6、、甲氧滴滴涕和甲苯氟磺胺，顯著降低了糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的抗炎蛋白GILZ基因的表達(dá)。分子對(duì)接模擬結(jié)果顯示篩選出的12種拮抗劑與GR的結(jié)合可能具有不同的結(jié)合模式。我們的研究結(jié)果表明，多種農(nóng)藥和農(nóng)藥代謝產(chǎn)物存在糖皮質(zhì)激素干擾作用，對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。
　　(2)檢測(cè)了43種常用農(nóng)藥及農(nóng)藥代謝產(chǎn)物對(duì)MR的干擾作用，并對(duì)其干擾機(jī)制進(jìn)行了初步探索。所測(cè)農(nóng)藥對(duì)MR均不存在顯著的激動(dòng)作用。而其中16種化合物，包括4種擬除蟲菊酯農(nóng)藥（氯

7、氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、芐氯菊酯、氰戊菊酯）、4種有機(jī)氯農(nóng)藥（o,p'-DDT、p,p'-DDT、p,p'-DDE和甲氧滴滴涕）、2種有機(jī)磷農(nóng)藥（乙酰甲胺磷、樂(lè)果），酰胺類除草劑甲草胺、三嗪除草劑特丁津、三嗪除草劑莠去津代謝產(chǎn)物、氨基甲酸酯類殺菌劑代森鋅、苯基吡唑類殺蟲劑氟蟲腈，顯著的減弱了醛固酮對(duì)MR轉(zhuǎn)錄活性的激活，具有鹽皮質(zhì)激素拮抗作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這16種MR拮抗劑顯著抑制了人血管平滑肌細(xì)胞中的鹽皮質(zhì)激素響應(yīng)基因堿性磷酸酶（alka

8、line phosphatase）的表達(dá)，并干擾了MR介導(dǎo)的醛固酮在肝癌細(xì)胞SMMC-7721中抑癌作用。聯(lián)合暴露實(shí)驗(yàn)中，這16種MR拮抗劑混合物在低濃度下即可表現(xiàn)出明顯的MR拮抗作用。與相加作用模型、獨(dú)立作用模型方程式預(yù)測(cè)值比對(duì)，聯(lián)合暴露的拮抗作用符合相加模型。MR核轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制醛固酮誘導(dǎo)的MR核轉(zhuǎn)移是化合物干擾MR轉(zhuǎn)錄活性的重要機(jī)制之一。
　　(3)檢測(cè)了15種常用金屬對(duì)GR以及MR的干擾作用。在最高無(wú)細(xì)胞毒性濃度下

9、，15種金屬均未表現(xiàn)出類糖/鹽皮質(zhì)激素活性。有7種金屬鹽表現(xiàn)出明顯的GR拮抗作用，5種金屬鹽表現(xiàn)出MR拮抗作用。除了Cu(Ⅱ)和Li(Ⅰ)以外，Ba(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、Sn(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)是首次被報(bào)道可干擾GR的轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí)，本研究也是首次證明Cd(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、Li(Ⅰ)、Mn(Ⅱ)和Sn(Ⅱ)暴露干擾了MR的轉(zhuǎn)錄活性和MR介導(dǎo)的醛固酮對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑癌作用。其中，Pb(Ⅱ)、Li(Ⅰ)和Sn(Ⅱ)