苯中毒的骨髓造血細(xì)胞microRNA表達(dá)譜與miR-34a-5p對(duì)苯毒性的調(diào)控研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　苯暴露可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生造血毒性，導(dǎo)致造血系統(tǒng)疾病的發(fā)生，其毒性機(jī)制主要是抑制骨髓造血干細(xì)胞的增殖與分化功能。miRNA是一類(lèi)非編碼小分子RNA，參與多種生理和病理過(guò)程的調(diào)控，包括造血干細(xì)胞的自我更新、分化和造血微環(huán)境間的調(diào)控。最近的研究發(fā)現(xiàn)特定的miRNA與外源性有害物質(zhì)暴露產(chǎn)生的毒性作用之間具有相關(guān)性，但是miRNA在苯暴露導(dǎo)致的骨髓造血細(xì)胞中的調(diào)控作用并不清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建苯中毒小鼠模型，在骨髓Lin-細(xì)

2、胞水平對(duì)苯中毒導(dǎo)致的miRNA差異表達(dá)譜進(jìn)行分析，并驗(yàn)證差異表達(dá)的造血相關(guān)miRNA在骨髓造血祖細(xì)胞(Lin-c-Kit+)水平的表達(dá)。通過(guò)苯暴露導(dǎo)致的骨髓造血細(xì)胞miRNA差異表達(dá)譜結(jié)合苯暴露后小鼠骨髓造血細(xì)胞的差異蛋白表達(dá)譜對(duì)造血相關(guān)miRNA進(jìn)行miRNA-mRNA共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出miR-34a-5p在其中發(fā)揮主要調(diào)控作用;構(gòu)建miR-34a-5p過(guò)表達(dá)和表達(dá)抑制的K562細(xì)胞模型，在此基礎(chǔ)上研究miR-34a-5p在1

3、，4-BQ對(duì)K562細(xì)胞毒性中發(fā)揮的生物學(xué)功能;在K562細(xì)胞中識(shí)別并驗(yàn)證miR-34a-5p的靶基因，研究miR-34a-5p的靶基因在1，4-BQ對(duì)K562細(xì)胞毒性中發(fā)揮的調(diào)控作用;研究miR-34a-5p在病例組和對(duì)照組人群中的表達(dá)水平，為苯中毒機(jī)制及生物標(biāo)志提供新的科學(xué)線索和依據(jù)。
　　第一章苯中毒小鼠骨髓造血細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜
　　以雄性C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用皮下注射的方式進(jìn)行染毒，苯染毒組濃度為1

4、50 mg/(kg-b.w.)，每周染毒5天，連續(xù)染毒4周，對(duì)照組小鼠皮下注射同等劑量的食用調(diào)和油。染毒結(jié)束后對(duì)小鼠的一般毒性和造血毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中一般毒性包括體重和臟器系數(shù)，造血毒性包括血常規(guī)、造血干細(xì)胞比例和骨髓細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果顯示苯染毒可導(dǎo)致小鼠體重和胸腺體比顯著降低(p＜0.05)。外周血檢測(cè)結(jié)果顯示苯染毒組小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞明顯低于對(duì)照組(p＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓中造血細(xì)胞比例的結(jié)果表明苯暴露

5、可導(dǎo)致骨髓Lin-c-Kit+細(xì)胞和造血干細(xì)胞(Lin-c-KitSca-1+)的比例明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。苯染毒組小鼠骨髓中造血干細(xì)胞的ROS水平明顯高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。
　　在上述苯中毒小鼠模型基礎(chǔ)上，通過(guò)流式細(xì)胞儀分選出骨髓Lin-細(xì)胞，提取RNA后進(jìn)行Illumina測(cè)序篩選出與苯暴露相關(guān)的miRNA差異表達(dá)譜。與陰性對(duì)照組小鼠相比，苯中毒組小鼠骨髓Lin-細(xì)胞中有45個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)

6、，5個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)。
　　第二章苯中毒造血相關(guān)差異表達(dá)miRNA的篩選及信號(hào)通路富集分析
　　應(yīng)用qRT-PCR在骨髓Lin-細(xì)胞水平對(duì)8個(gè)造血相關(guān)miRNA(mmu-miR-34a-5p、mmu-miR-129b-5p、mmu-miR-451 a、mmu-miR-144-5p、mmu-miR-342-3p、mmu-miR-196b-5p、mmu-miR-100-5p和mmu-miR-181 a-5p)的表達(dá)水平進(jìn)行檢

7、測(cè)并驗(yàn)證。結(jié)果顯示，qRT-PCR與Illumina測(cè)序的結(jié)果一致，即苯暴露可導(dǎo)致骨髓Lin-細(xì)胞中mmu-miR-34a-5p、mmu-miR-129b-5p、mmu-miR-451a和mmu-miR-144-5p的表達(dá)上調(diào)，mmu-miR-342-3p、mmu-miR-196b-5p、mmu-miR-100-5p和mmu-miR-181 a-5p的表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步在骨髓Lin-c-Kit+細(xì)胞水平對(duì)差異表達(dá)的造血相關(guān)miRNA的表達(dá)

8、進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，苯暴露可導(dǎo)致mmu-miR-34a-5p、mmu-miR-342-3p、mmu-miR-196b-5p、mmu-miR-100-5p和mmu-miR-181a-5p的表達(dá)在骨髓Lin-c-Kit+細(xì)胞水平發(fā)生改變，表達(dá)趨勢(shì)與骨髓Lin-細(xì)胞一致。
　　通過(guò)比對(duì)上述8個(gè)造血相關(guān)miRNA在人和小鼠中的序列，發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p、miR-451a、miR-100-5p、miR-181a-5p、miR-196b-

9、5p和miR-342-3p在人和小鼠中具有同源性。通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件結(jié)合苯暴露后小鼠骨髓造血細(xì)胞的差異蛋白表達(dá)譜的結(jié)果對(duì)造血相關(guān)miRNA的靶基因進(jìn)行分析，利用DAVID在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因參與的KEGG信號(hào)通路分析，結(jié)果顯示這些靶基因主要參與的信號(hào)通路有鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、促性腺激素釋放激素信號(hào)通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)、細(xì)胞骨架調(diào)控、ErbB信號(hào)傳導(dǎo)途徑、MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路和細(xì)胞周期。在此基礎(chǔ)上對(duì)差異表達(dá)的造血相

10、關(guān)miRNA構(gòu)建miRNA-mRNA的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果提示表達(dá)上調(diào)的miR-34a-5p可能通過(guò)靶向調(diào)控多種靶基因參與上述信號(hào)通路在苯誘導(dǎo)的造血毒性中發(fā)揮主要調(diào)控作用，其次是表達(dá)下調(diào)的miR-342-3p和miR-196b-5p。
　　第三章 miR-34a-5p在1，4-BQ致K562細(xì)胞毒性中的生物學(xué)功能
　　構(gòu)建苯的代謝終產(chǎn)物1，4-BQ暴露的K562細(xì)胞模型，采用qRT-PCR方法檢測(cè)1，4-BQ染毒K562細(xì)胞

11、后miR-34a-5p的表達(dá)改變。結(jié)果表明，miR-34a-5p的表達(dá)隨著1，4-BQ染毒濃度的增加及染毒時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇在細(xì)胞模型與動(dòng)物模型一致的miR-34a-5p。同時(shí)在該細(xì)胞模型上研究1，4-BQ對(duì)K562細(xì)胞的毒性作用，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化和ROS。細(xì)胞增殖的結(jié)果表明隨著1，4-BQ染毒濃度和染毒時(shí)間的增加，K562細(xì)胞的增殖率逐漸降低。細(xì)胞周期的

12、結(jié)果顯示，G0/G1期和G2期細(xì)胞比例隨著染毒濃度的增加而降低，S期細(xì)胞比例隨著染毒濃度的增加而增加。細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示1，4-BQ可顯著增加K562細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。流式細(xì)胞儀檢測(cè)1，4-BQ染毒K562.細(xì)胞對(duì)其向巨核細(xì)胞分化的影響，結(jié)果顯示較高濃度1，4-BQ(20μM和40μM)可顯著增加CD41a的表達(dá)，促進(jìn)K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化。1，4-BQ染毒K562細(xì)胞2h可促使細(xì)胞

13、內(nèi)ROS顯著增加。
　　通過(guò)qRT-PCR確定miR-34a-5p mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件。qRT-PCR的結(jié)果表明K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染30 nM mimic和200 nM inhibitor24h可顯著增加和降低miR-34a-5p的表達(dá)(p＜0.05)，因此后續(xù)研究選擇該轉(zhuǎn)染濃度模擬miR-34a-5p過(guò)表達(dá)和表達(dá)抑制在1,4-BQ致K562細(xì)胞毒性中的生物學(xué)作用。結(jié)果表明，抑制K562細(xì)胞中

14、miR-34a-5p的表達(dá)可抑制1，4-BQ對(duì)K562細(xì)胞的增殖毒性作用，如K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a-5p inhibitor后，20μM1，4-BQ染毒組再染毒24h，K562細(xì)胞增殖率高于陰性轉(zhuǎn)染組(p＜0.05)。細(xì)胞周期的結(jié)果表明，與陰性轉(zhuǎn)染組相比，K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimic后用20μM1，4-BQ染毒24 h可導(dǎo)致K562細(xì)胞S期細(xì)胞比例增加(p＜0.05)。細(xì)胞分化的結(jié)果表明，與陰性轉(zhuǎn)染組相比，在

15、K562細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-34a-5p可促進(jìn)20μM1，4-BQ染毒過(guò)程中向巨核細(xì)胞分化(p＜0.05)。細(xì)胞凋亡和ROS的結(jié)果表明，miR-34a-5p對(duì)1，4-BQ致K562細(xì)胞凋亡和ROS的毒性作用沒(méi)有影響。
　　第四章 miR-34a-5p在1,4-BQ致K562細(xì)胞毒性中的調(diào)控機(jī)制
　　通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件結(jié)合小鼠苯暴露后骨髓造血細(xì)胞的差異蛋白表達(dá)譜的結(jié)果及miR-34a-5p可參與調(diào)控K562細(xì)胞的細(xì)胞周期的結(jié)果

16、，初步篩選出miR-34a-5p的候選靶基因STAG1、STAG2和PCNA。qRT-PCR結(jié)果顯示miR-34a-5p mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞后，候選靶基因STAG1、STAG2和PCNA在mRNA水平未發(fā)生明顯改變。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明在K562細(xì)胞中高表達(dá)miR-34a-5p可抑制STAG1和STAG2的蛋白表達(dá)，抑制miR-34a-5p的表達(dá)可促進(jìn)STAG1和STAG2的蛋白表達(dá)，且差異

17、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，改變K562細(xì)胞中miR-34a-5p的表達(dá)對(duì)PCNA的蛋白表達(dá)沒(méi)有影響。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明過(guò)表達(dá)miR-34a-5p可導(dǎo)致含有野生型STAG13'UTR和STAG23'UTR的熒光素酶活性下降(p＜0.05)，說(shuō)明miR-34a-5p可通過(guò)與STAG1和STAG2的3'UTR區(qū)結(jié)合直接靶向調(diào)節(jié)STAG1和STAG2。
　　為了進(jìn)一步研究miR-34a-5p在miR-34a-5p在1，4-B

18、Q致K562細(xì)胞毒性中的調(diào)控機(jī)制，Western blot檢測(cè)了miR-34a-5p的靶基因在1，4-BQ染毒K562細(xì)胞過(guò)程中的表達(dá)改變。結(jié)果表明與陰性轉(zhuǎn)染組相比，K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimic24 h可顯著降低20μM1，4-BQ染毒24 h后STAG1和STAG2的蛋白表達(dá)水平，分別是陰性轉(zhuǎn)染組的0.41和0.79，而轉(zhuǎn)染inhibitor后可顯著增加20μM1，4-BQ染毒24 h后STAG1和STAG2的蛋白

19、表達(dá)水平，分別是陰性轉(zhuǎn)染組的1.76和3.18倍，且與陰性轉(zhuǎn)染組對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。
　　第五章 miR-34a-5p對(duì)職業(yè)苯暴露人群血液毒性的影響
　　收集苯暴露人群外周血樣本，根據(jù)血常規(guī)檢查及復(fù)查的白細(xì)胞計(jì)數(shù)將苯作業(yè)人員分為對(duì)照組(WBC≥4.5×109/L)和病例組(WBC＜4.5×109/L)，按年齡和性別進(jìn)行1∶1配對(duì)，每組各35例，研究暴露于同樣苯環(huán)境的對(duì)照組和病例組人群外周血中miR-34a-5

20、p的表達(dá)是否存在差異?？ǚ椒治龅慕Y(jié)果顯示本研究納入的對(duì)照組和病例組人群的年齡、性別、吸煙和飲酒都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。qRT-PCR結(jié)果表明病例組人群外周血中miR-34a-5p的表達(dá)水平是對(duì)照組人群的1.91倍，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。因此miR-34a-5p的表達(dá)上調(diào)可能與苯暴露導(dǎo)致苯中毒之間具有一定的相關(guān)性。
　　總結(jié)
　　本研究成功構(gòu)建苯中毒小鼠模型，結(jié)果表明苯對(duì)造血系統(tǒng)的毒性作用主要是抑制骨髓造

21、血干細(xì)胞的增殖與分化功能。通過(guò)Illumina測(cè)序發(fā)現(xiàn)苯暴露可導(dǎo)致骨髓Lin-細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜發(fā)生改變。qRT-PCR方法驗(yàn)證了Illumina測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，并且驗(yàn)證了苯暴露可在骨髓Lin-c-Kit+細(xì)胞水平導(dǎo)致造血相關(guān)miRNA的表達(dá)發(fā)生改變。通過(guò)苯暴露骨髓Lin-c-Kit+細(xì)胞中異常表達(dá)的miRNA與差異蛋白表達(dá)譜構(gòu)建miRNA-mRNA共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p可能通過(guò)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、卵母細(xì)胞

22、減數(shù)分裂、ErbB信號(hào)傳導(dǎo)途徑、Wnt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和細(xì)胞周期等信號(hào)通路參與苯誘導(dǎo)的造血毒性。
　　通過(guò)構(gòu)建miR-34a-5p過(guò)表達(dá)和表達(dá)抑制的K562細(xì)胞模型，結(jié)果表明miR-34a-5p可與細(xì)胞周期信號(hào)通路相關(guān)基因STAG1和STAG2的3'UTR區(qū)結(jié)合，在蛋白水平調(diào)控STAG1和STAG2的表達(dá)，從而影響K562細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。進(jìn)一步通過(guò)1，4-BQ染毒miR-34a-5p過(guò)表達(dá)和表達(dá)抑制的K562細(xì)胞，結(jié)

23、果表明抑制K562細(xì)胞中miR-34a-5p的表達(dá)可抑制1，4-BQ對(duì)K562細(xì)胞的增殖毒性作用。miR-34a-5p可通過(guò)調(diào)控STAG1和STAG2的蛋白表達(dá)影響1，4-BQ染毒過(guò)程中K562細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，從而影響苯及其代謝終產(chǎn)物誘導(dǎo)的造血毒性作用。
　　與對(duì)照組人群相比，miR-34a-5p在病例組人群外周血中呈表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明miR-34a-5p的表達(dá)增加可能促進(jìn)苯暴露人群發(fā)生苯中毒。
　　綜上，本課題首次在骨