河蜆多糖結構特征、生物活性及其對人體腸道菌群的影響.pdf

1、河蜆(Corbicula fluminea)是雙殼類軟體動物，又稱黃蜆，在我國的東部沿海地區(qū)多有分布。本草綱目記載河蜆作為中藥的藥材，具有開胃、通乳、明目、利尿、去濕毒、治療肝病、麻疹、退熱、止咳化痰、解酒等功效。目前對河蜆功能成份的研究主要集中在蛋白和脂類物質方面，對多糖的研究還較少，而且不夠深入。本論文對河蜆多糖進行系統(tǒng)的研究，包括提取條件優(yōu)化、分離純化、結構特性、抗氧化活性、抗腫瘤活性以及對人體腸道菌群微生態(tài)的影響等方面。主要結果

2、如下:
　　1、河蜆多糖超聲輔助酶法提取條件的優(yōu)化
　　選擇提取溫度、提取時間、液料比及超聲強度4個因素分別進行單因素實驗，確定了各因素在RSM實驗中的取值中心點。在單因素實驗基礎上，運用doehlert matrix(DM)設計對提取溫度、提取時間、液料比及超聲強度4個參數(shù)的實驗組合進行優(yōu)化。運用Matlab軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理分析，得出最優(yōu)提取條件為提取溫度60℃、提取時間30min、液料比35ml/g、超聲強度300

3、W。在此條件下，河蜆得率值為35.4％。
　　2、河蜆多糖的分離純化及理化性質
　　運用陰離子交換柱和凝膠層析柱對河蜆粗多糖進行分離純化，得到CFPS-1和CFPS-2。采用HPSEC對CFPS-1和CFPS-2的純度和分子量作近一步鑒定，其相對分子質量分別是283和22kDa。運用化學、物理的方法分別對粗CFPS、CFPS-N、CFPS-1和CFPS-2的化學特征進行分析。其中CFPS-1的蛋白含量(10.8％)、糖醛酸含

4、量(14.34％)相對較高，而CFPS-2的總糖含量(94.4％)及硫酸基含量(8.1％)相對較高。單糖分析表明粗CFPS、CFPS-N、CFPS-1主要由葡萄糖組成，而CFPS-2主要由葡萄糖、半乳糖、巖藻糖、氨基半乳糖、氨基葡萄糖組成，各單糖比例分別是0.7∶0.3∶0.9∶0.2∶0.2。
　　3、河蜆多糖的結構解析
　　運用原子力顯微鏡(AFM)對河蜆多糖進行觀察，發(fā)現(xiàn)CFPS-N分子相互盤繞呈球形。CFPS-1和C

5、FPS-2中可以看到單獨游離于溶液中的糖鏈，糖鏈直徑是在10-20nm之間，長度為1500-2000nm之間。結合多糖甲基化、GC-MS及核磁共振技術分析的結果，推測出CFPS-1及CFPS-2可能的結構。
　　4、河蜆多糖的抗氧化、抗腫瘤活性
　　體外抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，與河蜆粗糖(CFPS和CFPS-N)相比，純化產(chǎn)物CFPS-1和CFPS-2有較強的抗氧化活性。體外抗腫瘤活性篩選結果表明，CFPS-1對人乳腺癌細胞(M

6、DA-MB-231)的抗增殖效果最為顯著。末端轉移酶標記技術(TUNNEL)顯示隨著CFPS-1濃度的增加可以很好的誘導MDA-MB-231細胞的凋亡。因此，我們近一步采用蛋白質印記技術研究細胞周期相關蛋白的表達情況，結果表明其機制很可能是通過對ASK1蛋白的活化，進一步激活p38/p53途徑。p53蛋白的增加一方面抑制Cyclin D1、CDK4和PCNA蛋白的表達，最終誘導細胞周期阻滯，抑制癌癥細胞過度增殖。同時，還可以使線粒體中C

7、aspase-3酶原裂解成為活性蛋白Caspase-3酶，最終激活凋亡特異性核酸內(nèi)切酶誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。
　　5、河蜆多糖對人體腸道菌群微生態(tài)的影響
　　我們發(fā)現(xiàn)在沒有微生物參與的情況下，胃-腸道消化液對河蜆多糖CFPS-N的降解作用很有限。近一步研究腸道菌群與CFPS-N的代謝關系中發(fā)現(xiàn)，CFPS-N能夠被腸道微生物所降解，并且發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物中乙酸、丙酸和丁酸的含量較高。DGGE的結果發(fā)現(xiàn)代謝多糖后的菌群結構主要由厚壁菌