基于光譜學(xué)技術(shù)研究幾種食品添加劑與生物大分子的作用機(jī)制.pdf

1、食品添加劑是食品工業(yè)創(chuàng)新發(fā)展的重要基礎(chǔ)之一，對食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到重要的推動作用。食品添加劑在提高食品的品質(zhì)，改善食品的色、香、味以及延長食品的貨架壽命等方面具有重要意義，然而攝入過多的食品添加劑可能對人們健康產(chǎn)生潛在的危害，因此，必須嚴(yán)格控制其在食品中的使用量。生物大分子如人血清白蛋白、DNA是許多有害小分子的作用標(biāo)靶，它們常被用作大分子模型以研究生物大分子的結(jié)構(gòu)功能性質(zhì)以及分析小分子的毒理學(xué)性質(zhì)。本文在生理酸度(pH7.4)的條件下，

2、通過構(gòu)建多種光譜學(xué)技術(shù)包括熒光光譜法、紫外吸收光譜法、圓二色譜法(CD)和傅里葉紅外光譜法(FT–IR)與分子模擬結(jié)合的方法體系，研究了誘惑紅、糖精鈉和丁基羥基茴香醚等幾種人工合成食品添加劑與人血清白蛋白、DNA的相互作用機(jī)制，為深入認(rèn)識上述食品添加劑產(chǎn)生潛在危害化學(xué)本質(zhì)提供理論依據(jù)，也為體外評估食品添加劑毒理學(xué)性質(zhì)提供新的思路和技術(shù)支撐。
　　本文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果概述如下：
　　1.簡要介紹了食品添加劑的使用現(xiàn)狀、毒理

3、學(xué)性質(zhì)評價的常用手段以及食品添加劑與生物大分子作用的研究方法和研究進(jìn)展。
　　2.在模擬人體生理pH條件下，聯(lián)合采用FT–IR、CD和熒光等光譜方法以及分子模擬等技術(shù)，研究了人工合成食品著色劑誘惑紅(allura red，AR)與人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的結(jié)合機(jī)制，探討了AR對HSA結(jié)構(gòu)的影響。實驗結(jié)果表明，AR通過靜態(tài)猝滅即生成基態(tài)復(fù)合物的方式猝滅 HSA的熒光，計算的熱力學(xué)參數(shù)表明兩者的結(jié)

4、合力主要為氫鍵和疏水作用力。AR與 HSA的結(jié)合常數(shù)104 L mol?1數(shù)量級，存在中等強(qiáng)度的親和力，AR主要結(jié)合在HSA亞域IIA的疏水性空腔，即Site I，結(jié)合位點距色氨酸的距離為2.92 nm。分子模擬的結(jié)果證實了AR在HSA上的結(jié)合位點并直觀地展現(xiàn)了其結(jié)合模式。研究發(fā)現(xiàn)，AR與HSA結(jié)合導(dǎo)致HSA微環(huán)境的改變，HSA的二級結(jié)構(gòu)α-螺旋和無規(guī)則卷曲含量增加，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的含量降低，蛋白質(zhì)的表面疏水性降低，多肽鏈有所收縮。

5、
　　3.采用分子對接技術(shù)預(yù)測了食品甜味劑糖精鈉(sodium saccharin，SSA)與HSA結(jié)合模式，并在此基礎(chǔ)上研究了SSA與HSA結(jié)合機(jī)制。發(fā)現(xiàn)SSA能夠與HSA生成復(fù)合物并引起HSA熒光猝滅。位點競爭實驗表明，SSA與HSA結(jié)合位點數(shù)為1，結(jié)合位點位于HSA的Site I。SSA與HSA結(jié)合導(dǎo)致HSA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響多肽主鏈的正常結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)了α-螺旋含量的下降。
　　構(gòu)建了基于化學(xué)計量學(xué)多元曲線分辨?交替最小

6、二乘法(MCR–ALS)結(jié)合熒光、紫外、FT–IR、CD技術(shù)以及分子模擬和熔點、粘度測量的方法體系，測定了生理酸度條件下SSA與小牛胸腺DNA(Calf Thymus DNA，ctDNA)的結(jié)合性質(zhì)，探索了兩者的作用機(jī)制。采用MCR–ALS方法解析SSA與ctDNA反應(yīng)體系的熒光和紫外擴(kuò)展數(shù)據(jù)矩陣，獲得了反應(yīng)組分(SSA、ctDNA和SSA–ctDNA復(fù)合物)的濃度變化和純組分的光譜曲線，實現(xiàn)了SSA–ctDNA相互作用的定量監(jiān)測。鹽效

7、應(yīng)、碘離子效應(yīng)、ctDNA熔點和粘度結(jié)果表明，SSA主要結(jié)合在ctDNA的小溝富集區(qū)，這種結(jié)合模式得到分子模擬結(jié)果的進(jìn)一步證實。FT–IR、CD和凝膠電泳結(jié)果表明，SSA主要與ctDNA的G堿基發(fā)生特異性結(jié)合，這種結(jié)合引起DNA的B構(gòu)象向A構(gòu)象轉(zhuǎn)變，但SSA沒有造成DNA損傷。
　　4.在pH7.4條件下，采用多種光譜方法結(jié)合MCR–ALS和分子對接技術(shù)測定了食品抗氧化劑丁基羥基茴香醚(BHA)與ctDNA的相互作用。ctDNA的

8、熔點和粘度升高以及亞甲基藍(lán)(MB)熒光探針競爭實驗結(jié)果表明，BHA與ctDNA的結(jié)合模式為嵌插作用。FT–IR和CD分析結(jié)果顯示，BHA主要結(jié)合于ctDNA的胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)堿基富集區(qū)，這種結(jié)合模式在一定程度上干擾了DNA堿基對之間的π?π堆積，進(jìn)而導(dǎo)致 DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。分子模擬描述了BHA–ctDNA結(jié)合的立體姿態(tài)和結(jié)合模式。pUC18質(zhì)粒DNA凝膠電泳測試表明，BHA未引起DNA明顯損傷。運用MCR–ALS方法將BH

9、A與ctDNA反應(yīng)體系的重疊紫外吸收光譜數(shù)進(jìn)行了分辨和解析，得到了目標(biāo)組分 BHA、ctDNA、BHA–ctDNA復(fù)合物的純光譜信號和相對濃度變化，直觀、定量地呈現(xiàn)了BHA–ctDNA相互作用的動力學(xué)進(jìn)程。
　　5.運用多種光譜分析方法和分子模擬等技術(shù)系統(tǒng)地研究了2-叔丁基對甲苯酚(TBMP)與2-羥丙基-β環(huán)糊精(Hp-βCD)和ctDNA的相互作用。發(fā)現(xiàn)TBMP能夠與Hp-βCD形成1:1包合物，兩者的包合常數(shù)為7.15×10

10、3 L mol–1。運用化學(xué)計量學(xué)MCR–ALS方法對TBMP與ctDNA反應(yīng)的重疊的熒光和紫外光譜進(jìn)行分辨和解析，獲得了各反應(yīng)組分的濃度變化曲線，此據(jù)可直觀地監(jiān)測反應(yīng)的動力學(xué)過程。TBMP能夠引起DNA的熔點和粘度明顯增大，且能夠與嵌插劑亞甲基藍(lán)(MB)發(fā)生競爭作用，結(jié)合分子模擬的研究結(jié)果，證實TBMP通過嵌插方式作用于ctDNA的堿基對。FT–IR和CD分析表明，TBMP主要結(jié)合在DNA的G、C富集區(qū)，這種特異性的結(jié)合能夠引起 ct