PERK介導的內質網應激在Cx43調控頸椎后縱韌帶骨化過程中的作用研究.pdf

1、目的：頸椎后縱韌帶骨化癥(OPLL)好發(fā)于65歲以上的東亞人群，其特點表現(xiàn)為后縱韌帶的增生、肥厚和骨化，伴隨著骨化的進展，可逐漸加重椎管狹窄以及脊髓和神經根受壓的程度，進而出現(xiàn)不同程度的神經受損表現(xiàn)，嚴重影響生活質量。目前尚無療效滿意的保守療法，如果癥狀嚴重，患者最終會選擇手術治療，但也存在一些問題，比如風險較高;易出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥;手術療效對于有些患者而言并不確切。因此目前的研究重點是探尋其發(fā)病機制。經過多年的研究，遺傳、微環(huán)境、代謝

2、、力學改變等學說被廣為接受，但這些尚難以解釋其完整的發(fā)病機理，需要更進一步探索。①近年來有研究顯示，PERK介導的內質網應激(ERS)是人體內成骨作用、骨形成不可或缺的重要機制，且可在機械應力誘導牙周韌帶細胞骨化過程中發(fā)揮調控作用，但對于頸椎后縱韌帶骨化的影響尚無報道，需要我們去驗證該現(xiàn)象在機械應力誘導OPLL過程中的作用機制。②在我們的既往研究中發(fā)現(xiàn)，OPLL患者后縱韌帶細胞表達Cx43要明顯高于非骨化患者，而且初步證實在頸椎后縱韌帶

3、骨化的過程中，Cx43可能發(fā)揮了重要的調控作用;目前研究發(fā)現(xiàn)Cx43可通過ERK調節(jié)成骨、軟骨細胞代謝，且Src/MEK/ERK通路與OPLL發(fā)病機制密切相關，因此需要探討Cx43是否可通過MAPK相關通路調控OPLL。③有文獻報道在某些病理過程中，Cx43可通過ERS發(fā)揮相應的調節(jié)作用;且ERS可激活MAPK家族信號通路，進而調控細胞的各種生命活動。明確在應力刺激作用下，Cx43是否可通過PERK介導的ERS激活MAPK信號通路，進而

4、調控骨化，有利于進一步認識OPLL的發(fā)病機制。
　　方法：自2015年12月至2017年6月，16名頸椎后縱韌帶骨化和24名非骨化患者，均采取頸椎前路減壓（經椎間隙或椎體次全切除）植骨融合內固定術，術中收取大塊后縱韌帶組織標本，盡量避免使用槍狀咬骨鉗嵌壓韌帶組織。采取酶消化法分離、培養(yǎng)韌帶細胞，對細胞內波狀蛋白進行免疫組化染色以鑒定后縱韌帶細胞，并進行后續(xù)分子生物學研究。具體步驟為:①取第3代骨化和非骨化組韌帶細胞，采用RT-PC

5、R檢測mRNA水平的表達，Western-blotting檢測蛋白水平的表達，比較兩組間PERK、CHOP、GRP78等ERS相關指標和ALP、OCN、COLⅠ等成骨標志物的表達差異;采用Flexercell應力加載系統(tǒng)對非骨化組細胞施加應力刺激，比較刺激前后上述指標及流式細胞儀檢測活性氧(ROS)水平的改變;用PERK通路特異性抑制劑抑制非骨化組細胞的ERS，再予以應力刺激，觀察各項成骨標志物的表達變化。②利用免疫組化法比較骨化組和非

6、骨化組韌帶細胞內p38MAPK、ERK1/2和JNK等MAPK相關指標的磷酸化水平，Western-blotting檢測應力刺激對上述指標在非骨化組細胞內磷酸化程度的影響;制備Cx43的siRNA序列，采用慢病毒攜帶此序列轉染細胞，分別從基因及蛋白表達水平檢驗其抑制效率，并進一步觀察干擾Cx43對于機械應力激活MAPK通路的影響;依次干擾Cx43和特異性抑制p38MAPK、ERK1/2、JNK各通路后，檢測應力刺激下各項成骨標志物的基因

7、表達。③干擾非骨化組細胞內的Cx43后予以應力刺激，檢測PERK、CHOP、GRP78的表達以及ROS水平，再過表達Cx43，觀察上述指標的變化;觀察抑制PERK介導的ERS對于機械應力激活MAPK通路的影響;在機械應力加載模型的基礎上，依次用siRNA/Cx43和PERK通路特異性激活劑處理非骨化患者的韌帶細胞，檢測MAPK相關指標的磷酸化程度和成骨標志物的表達。
　　結果：利用酶消化法培養(yǎng)第3代細胞生長狀態(tài)良好，形態(tài)穩(wěn)定，排列

8、有序;主要以長梭形和多角形為主，胞體豐富，呈放射狀、旋渦狀生長。骨化組及非骨化組細胞形狀無明顯區(qū)別。對波形蛋白采取免疫組化染色呈陽性，證實了其成纖維細胞性質。①通過檢測PERK、CHOP、GRP78等ERS相關指標和ALP、OCN、COLⅠ等成骨標志物在mRNA和蛋白水平的表達，發(fā)現(xiàn)骨化組均明顯高于非骨化組，差異顯著(p＜0.05);對非骨化患者的韌帶細胞施加應力刺激，發(fā)現(xiàn)上述指標的表達明顯上調，且流式細胞儀檢測ROS水平升高，與刺激前

9、相比差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);抑制PERK介導的ERS可顯著下調應力刺激誘導的成骨標志物的表達(p＜0.05)。②免疫組化檢測p38MAPK、ERK1/2和JNK等MAPK相關指標的磷酸化蛋白在骨化及非骨化組韌帶中均有表達，但骨化組明顯強于非骨化組;機械應力刺激非骨化患者的韌帶細胞后，WB檢測發(fā)現(xiàn)上述指標的磷酸化蛋白含量明顯升高(p＜0.05);成功構建了Cx43的siRNA，從mRNA及蛋白水平進行評價其抑制效率均大于70％;

10、干擾非骨化組韌帶細胞的Cx43可明顯抑制機械應力激活MAPK通路(p＜0.05);干擾Cx43及特異性抑制p38MAPK、ERK1/2通路可明顯下調機械應力誘導COLⅠ、OCN、ALP和Runx2等成骨標志物的表達(p＜0.05)，但在JNK通路抑制組差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，提示在OPLL過程中JNK通路的作用不顯著。③干擾非骨化組韌帶細胞內的Cx43可明顯下調應力刺激誘導PERK、CHOP、GRP78的表達以及ROS水平(p

11、＜0.05)，過表達Cx43后發(fā)現(xiàn)ERS相關指標及ROS水平均出現(xiàn)顯著上調;抑制PERK介導的ERS可顯著抑制機械應力激活MAPK通路(p＜0.05);在干擾Cx43的前提下，非骨化組韌帶細胞MAPK磷酸化和成骨分化受到抑制，再次激活PERK介導的ERS可以恢復機械應力對MAPK通路的激活以及成骨刺激作用。
　　結論：利用酶消化法可以在體外環(huán)境中成功分離、培養(yǎng)后縱韌帶組織細胞，并可通過波形蛋白染色證實其來源。①機械應力可刺激后縱韌