延髓頭端腹外側(cè)CBS-H2S系統(tǒng)在自發(fā)性高血壓大鼠發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、本研究旨在應(yīng)用基因過(guò)表達(dá)技術(shù)、心血管功能學(xué)、western blot、核團(tuán)顯微注射和免疫組化等方法探討內(nèi)源性H2S在RVLM對(duì)心血管調(diào)節(jié)功能及其作用機(jī)制。研究分為三部分:
　　第一部分 RVLM區(qū)過(guò)表達(dá)CBS基因?qū)BS蛋白和H2S水平的影響
　　目的:H2S具有與NO和CO相似的生物學(xué)特性，被認(rèn)為是第三種氣體信號(hào)分子。由于H2S本身存在半衰期短、代謝快的特點(diǎn)，給長(zhǎng)期給予H2S制造了瓶頸。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因治療作為有別

2、于傳統(tǒng)藥物治療的新治療手段顯示出巨大的潛力，重組腺病毒載體攜帶目的基因過(guò)表達(dá)技術(shù)日益成熟。RVLM中轉(zhuǎn)染攜帶CBS基因的腺病毒，能夠長(zhǎng)期生成H2S，為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)探討H2S的基因治療奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:將CBS cDNA(GenBank: M88344.1)連接到質(zhì)粒PMD19-Simple-T中，并將連接好的質(zhì)粒PMD19-Simple-T-CBS包裝到腺病毒載體上。將AdCBS轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞中，測(cè)定最佳MOI

3、值，同時(shí)測(cè)定了CBS和H2S的含量。顯微注射到大鼠的RVLM區(qū)，使CBS蛋白在RVLM區(qū)過(guò)表達(dá)。觀察CBS的表達(dá)周期，測(cè)定了RVLM區(qū)CBS蛋白表達(dá)情況和H2S的含量。
　　結(jié)果:通過(guò)Western blot、PCR及基因測(cè)序等方法證明已經(jīng)將CBS的cDNA成功包裝到PMD19-Simple-T質(zhì)粒中。隨后將PMD19-Simple-T-CBS質(zhì)粒包裝到腺病毒載體中（adenoviral vectors carrying CBS

4、gene，AdCBS）。AdEGFP(adenoviral vectors carrying enhanced green fluorescent protein)組為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染前后每隔一天，取RVLM區(qū)，觀察熒光，CBS蛋白和H2S的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染AdCBS后的第7天，RVLM區(qū)熒光最強(qiáng)，CBS蛋白和H2S水平最高，證明CBS成功轉(zhuǎn)染到RVLM區(qū)了。
　　結(jié)論:將CBS的cDNA構(gòu)建到了PMD19-Simple-T

5、質(zhì)粒中，隨后包裝到腺病毒載體中，并成功將AdCBS轉(zhuǎn)染到RVLM區(qū)，CBS蛋白和H2S含量明顯增加。
　　第二部分 RVLM過(guò)表達(dá)CBS對(duì)正常大鼠H2S介導(dǎo)的交感神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)控作用
　　目的:H2S是一種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，在外周具有舒張血管抵抗高血壓等保護(hù)作用，但其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)心血管的調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。H2S曾經(jīng)被報(bào)道在RVLM區(qū)具有交感抑制的效果。當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)判定長(zhǎng)期在RVLM給予H2S對(duì)血壓和交感神經(jīng)活動(dòng)的影響。

6、
　　方法:在本實(shí)驗(yàn)中，血壓正常大鼠RVLM區(qū)AdCBS轉(zhuǎn)染7天后，進(jìn)行急性實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:1.RVLM區(qū)注射AdCBS7天后，檢測(cè)RVLM區(qū)CBS表達(dá)和H2S的含量?；蜣D(zhuǎn)染7天后，與AdEGFP相比，AdCBS組CBS蛋白增加了83％。此外AdCBS組H2S水平也顯著高于AdEGFP組。
　　2.基因轉(zhuǎn)染前后，測(cè)定了各組大鼠清醒狀態(tài)的SBP和HR，AdCBS組與AdEGFP組組間無(wú)差異。
　　3.顯微注射實(shí)

7、驗(yàn)前對(duì)RVLM進(jìn)行功能定位，單側(cè)RVLM微量注射L-谷氨酸后，觀察到血壓升高20～30mmHg，提示注射部位確實(shí)為RVLM。AdCBS組RVLM區(qū)顯微注射HA后，RSNA，MAP和HR均升高，但AdCBS組的升高幅度大于AdEGFP組。AdEGFP與未處理組，RSNA，MAP，HR升高的幅度組間無(wú)差異。
　　4.在基因轉(zhuǎn)染后的第七天，我們檢測(cè)了Kir6.1，Kir6.2，SUR1和SUR2蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示在AdCBS組Kir6.

8、1和SUR2蛋白表達(dá)升高，而SUR1和Kir6.2并沒(méi)有發(fā)生顯著改變。
　　結(jié)論:盡管RVLM過(guò)表達(dá)CBS并沒(méi)有影響SBP和HR，但是和AdEGFP組相比，在AdCBS組RVLM區(qū)顯微注射CBS抑制劑所誘發(fā)的RSNA，MAP和HR的增加幅度明顯增強(qiáng)。預(yù)先注射KATP通道激動(dòng)劑，HA的效果被取消;注射KAT，通道阻斷劑，AdCBS組RSNA，MAP和HR均升高，而AdEGFP組各變量沒(méi)有顯著改變，并且RVLM區(qū)增加了Kir6.1和S

9、UR2蛋白表達(dá)。這些結(jié)果提示RVLM區(qū)增加的KAT，通道可能為AdCBS組RVLM區(qū)顯微注射CBS抑制劑所導(dǎo)致的增強(qiáng)的升壓反應(yīng)負(fù)責(zé)。這些發(fā)現(xiàn)提示CBS/H2S系統(tǒng)可能是某些交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)疾病心血管基因治療的重要靶點(diǎn)。
　　第三部分 RVLM區(qū)CBS/H2S系統(tǒng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心血管活動(dòng)的調(diào)控作用
　　目的:SHR交感神經(jīng)過(guò)度激活。RVLM區(qū)對(duì)心血管的調(diào)控有重要的作用。在我們的實(shí)驗(yàn)中，和WKY大鼠相比，SHR的RVLM區(qū)的

10、CBS蛋白和H2S含量均降低。這些研究結(jié)果提示RVLM區(qū)CBS/H2S系統(tǒng)可能與交感神經(jīng)過(guò)度激活有關(guān)。因此，我們推測(cè)CBS/H2S系統(tǒng)可能在SHR的交感神經(jīng)過(guò)度激活和血壓升高中起重要作用。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)表明H2S和NO相互作用調(diào)節(jié)著心血管的功能。另外，SHR的RVLM區(qū)的NO介導(dǎo)交感抑制效果明顯減弱，因此我們猜測(cè)，H2S在SHR RVLM區(qū)對(duì)交感神經(jīng)的調(diào)控作用可能是通過(guò)CBS/H2S系統(tǒng)和NOS/NO系統(tǒng)相互作用實(shí)現(xiàn)的。所以，我們通過(guò)在

11、RVLM區(qū)過(guò)表達(dá)CBS來(lái)證明這個(gè)假說(shuō)。該研究有望闡明SHR RVLM中的CBS/H2S系統(tǒng)在交感神經(jīng)激活機(jī)制中的作用及其關(guān)鍵靶點(diǎn)，為防治原發(fā)性高血壓奠定理論基礎(chǔ)，提供新思路。
　　方法:利用基因過(guò)表達(dá)的方法，將AdCBS轉(zhuǎn)染到RVLM區(qū)，觀察RVLM增加的CBS/H2S系統(tǒng)對(duì)SHR清醒狀態(tài)下SBP, HR和RSNA的影響;應(yīng)用核團(tuán)顯微注射的方法，RVLM區(qū)顯微注射L-NMMA，觀察SHR RVLM區(qū)CBS/H2S系統(tǒng)對(duì)NOS/NO

12、系統(tǒng)的影響;Western blot等方法檢測(cè)RVLM區(qū)NOS/NO系統(tǒng)的的表達(dá)情況，并探討與RVLM區(qū)CBS/H2S系統(tǒng)與NOS/NO系統(tǒng)之間的相互關(guān)系。
　　結(jié)果:1.CBS基因轉(zhuǎn)染7天后，RVLM區(qū)CBS表達(dá)增加到最大值。另外，在基因轉(zhuǎn)染的第七天，Western blot結(jié)果顯示，SHR+AdEGFP組RVLM區(qū)CBS蛋白表達(dá)明顯低于WKY+AdEGFP組。AdCBS組RVLM區(qū)CBS蛋白的表達(dá)明顯高于AdEGFP組和未處理

13、組。然而，在SHR+AdCBS組和WKY+AdCBS組之間，CBS蛋白表達(dá)沒(méi)有差異。我們?cè)诨蜻^(guò)表達(dá)后的第7天也檢測(cè)了H2S的含量。AdCBS組的H2S的含量明顯高于AdEGFP組。SHR+AdEGFP組H2S的含量明顯低于WKY+AdEGFP組。WKY+AdCBS和SHR+AdCBS組H2S含量組間無(wú)差異。
　　2.在清醒狀態(tài)下，我們測(cè)定了各組大鼠的SBP和HR。在RVLM區(qū)CBS基因轉(zhuǎn)染后的第5天到第10天，SHR的SBP和H

14、R明顯升高，但是WKY組沒(méi)有改變。AdEGFP組SBP和HR和未處理組組間無(wú)差異。
　　在基因轉(zhuǎn)染前，SHR24小時(shí)尿中的去甲腎上腺素水平明顯高于WKY組。在基因轉(zhuǎn)染后的第7天，SHR+AdCBS組的尿中去甲腎上腺素水平明顯高于SHR+AdEGFP組。然而，在基因轉(zhuǎn)染前后，WKY+AdEGFP組和WKY+AdCBS組尿中的去甲腎上腺素水平?jīng)]有差異。
　　3.為了驗(yàn)證過(guò)表達(dá)CBS是否上調(diào)了NOS/NO系統(tǒng)，我們檢測(cè)了RVLM區(qū)

15、NOS蛋白和NOx的水平。SHR和WKY組RVLM區(qū)nNOS蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著差異。然而，SHR+AdCBS組RVLM區(qū)nNOS蛋白表達(dá)量明顯降低，和SHR+AdEGFP相比。WKY組組間無(wú)差異。ENOS和iNOS各組組間無(wú)差異。在SHR NOx水平明顯低于WKY組，并且CBS基因轉(zhuǎn)染后，NOx水平進(jìn)一步下降，但是NOx在WKY組組間沒(méi)有發(fā)生變化。
　　4.和WKY+AdEGFP相比，SHR+AdEGFP的GABA的水平明顯降低。基

16、因轉(zhuǎn)染后，SHR+AdCBS組GABA的水平進(jìn)一步降低，WKY+AdEGFP組和WKY+AdCBS組組間無(wú)差異。
　　5.在基因轉(zhuǎn)染后的第7天，各組RVLM區(qū)顯微注射L-NMMA導(dǎo)致了RSNA，動(dòng)脈血壓（arterial blood pressure，ABP）和HR的升高。在SHR+AdEGFP組RVLM區(qū)顯微注射L-NMMA誘發(fā)的升壓反應(yīng)明顯鈍化，和WKY+AdEGFP組相比。另外，SHR+AdCBS組L-NMMA所誘發(fā)的升壓反

17、應(yīng)的幅度明顯低于SHR+AdEGFP組，但是WKY組組間無(wú)差異。RVLM區(qū)顯微注射人工腦脊液(100 nL)，RSNA，ABP和HR沒(méi)有發(fā)生改變。
　　結(jié)論:當(dāng)前的研究表明SHR的RVLM區(qū)過(guò)表達(dá)CBS增加了SBP，HR和尿中的去甲腎上腺素水平。這些效果可能被NOS/NO系統(tǒng)介導(dǎo)。這些結(jié)果提示CBS/H2S系統(tǒng)和NOS/NO系統(tǒng)之間的相互作用影響了過(guò)度興奮的交感神經(jīng)活動(dòng)，并且SHR RVLM區(qū)減少的CBS蛋白可能是一個(gè)重要的補(bǔ)償機(jī)