氟喹諾酮類污染物對(duì)抗氧化酶的毒性效應(yīng)、機(jī)理及其檢測(cè)的研究.pdf

1、氟喹諾酮藥物是一類重要的人工合成抗生素。自上世紀(jì)80年代上市以來(lái)已逐步成為人類和獸類疾病預(yù)防和治療的一線藥物。然而，氟喹諾酮藥物的長(zhǎng)期大量使用導(dǎo)致它們持續(xù)不斷的流入環(huán)境并在環(huán)境中形成積累，成為一類廣受關(guān)注的環(huán)境微污染物。氟喹諾酮類污染物對(duì)生態(tài)環(huán)境及人類健康帶來(lái)的表觀和潛在的危害也成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。建立完善的氟喹諾酮類污染物環(huán)境毒理學(xué)評(píng)價(jià)體系和簡(jiǎn)便、靈敏的氟喹諾酮類污染物檢測(cè)方法對(duì)闡明氟喹諾酮類污染物的污染狀況及進(jìn)一步準(zhǔn)確評(píng)估它們對(duì)環(huán)境

2、和人類健康的潛在危害和風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。
　　過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)是需氧生物中普遍存在的兩種抗氧化酶，它們?cè)谙矬w內(nèi)活性氧、維持生物體氧化-還原平衡方面起著關(guān)鍵性作用。它們結(jié)構(gòu)和功能的變化與細(xì)胞凋亡、衰老及多種疾病密切相關(guān)。研究氟喹諾酮類污染物對(duì)這兩種抗氧化酶的毒性效應(yīng)和毒性機(jī)理是全面評(píng)價(jià)其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)。
　　酶聯(lián)免疫吸附分析是一種基于抗原-抗體的特異性免疫反應(yīng)及具有信號(hào)放大功能的酶促反應(yīng)

3、建立起來(lái)的用于定性或定量檢測(cè)抗原和抗體的生物化學(xué)分析技術(shù)。因其具有靈敏度高、特異性好、樣品容量大、簡(jiǎn)單易操作等優(yōu)點(diǎn)不僅已成為環(huán)境中（水、土壤、食品等）污染物檢測(cè)的重要方法之一，還已應(yīng)用于細(xì)胞毒理、動(dòng)物毒理及生態(tài)毒理等的研究中。建立氟喹諾酮污染物的酶聯(lián)免疫分析方法對(duì)這類污染物的環(huán)境檢測(cè)、毒理學(xué)研究及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估十分必要。
　　本文利用多種光譜分析方法（紫外-可見(jiàn)分光光度法、穩(wěn)態(tài)熒光光譜法、時(shí)間分辨熒光光譜法、圓二色譜法）結(jié)合等溫微量熱法

4、及計(jì)算機(jī)模擬方法從分子水平上研究了獸用氟喹諾酮藥物沙拉沙星(SARA)對(duì)過(guò)氧化氫酶(CAT)和銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)的毒性效應(yīng)和作用機(jī)制以及人獸共用氟喹諾酮藥物洛美沙星(LOME)在Cu2+存在下對(duì)CAT和Cu/ZnSOD的聯(lián)合毒性效應(yīng)和作用機(jī)制，并建立了化學(xué)發(fā)光-酶聯(lián)免疫高靈敏檢測(cè)洛美沙星和達(dá)氟沙星(DANO)的新方法。主要研究結(jié)果如下:
　　1.考察了SARA與CAT的相互作用及SARA對(duì)CAT的分子結(jié)構(gòu)和酶催

5、化活性的影響，探討了SARA導(dǎo)致的CAT的分子結(jié)構(gòu)變化與其催化活性之間的關(guān)系。光譜研究發(fā)現(xiàn)，SARA結(jié)合在CAT的芳香氨基酸色氨酸附近但距絡(luò)氨酸較遠(yuǎn)。SARA的結(jié)合改變了CAT分子中色氨酸的微環(huán)境結(jié)構(gòu)和CAT的二級(jí)結(jié)構(gòu)并影響了CAT活性中心鐵卟啉附近的氨基酸微環(huán)境。等溫微量熱滴定的研究結(jié)果表明SARA與CAT的相互作用伴隨有少量的吸熱現(xiàn)象，說(shuō)明在SARA與CAT和Cu/ZnSOD的結(jié)合主要為熵驅(qū)動(dòng)過(guò)程，據(jù)此推測(cè)疏水作用力應(yīng)為SARA與C

6、AT之間的主要作用力。為了解SARA導(dǎo)致的CAT的結(jié)構(gòu)變化對(duì)酶功能的影響，檢測(cè)了不同濃度SARA存在下CAT的催化活性，結(jié)果表明SARA對(duì)CAT的催化活性有輕微的抑制作用。計(jì)算機(jī)模擬研究顯示，SARA結(jié)合在CAT的兩條α-螺旋之間的疏水區(qū)域(LEU158-LYS168和ASP179-GLU190)，位于TRP182和TRP185附近，這與前面的研究結(jié)果一致，說(shuō)明模擬結(jié)果是可靠的。SARA通過(guò)影響PHE160而影響HEME卟啉環(huán)Ⅰ上的甲基

7、和乙烯基并進(jìn)而引起了HIS74與HEME相對(duì)位置的結(jié)構(gòu)變化是導(dǎo)致SARA對(duì)CAT催化活性產(chǎn)生抑制作用的主要原因。
　　2.研究了SARA與Cu/ZnSOD的相互作用及Cu/ZnSOD的結(jié)構(gòu)和催化活性之間的關(guān)系。SARA主要通過(guò)疏水作用力和氫鍵作用力與Cu/ZnSOD結(jié)合形成復(fù)合物，這一結(jié)合作用在SARA與Cu/ZnSOD的摩爾比達(dá)到4時(shí)趨于飽和。SARA能夠?qū)е翪u/ZnSOD分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)及絡(luò)氨酸附近的微環(huán)境發(fā)生改變但并未影響C

8、u/ZnSOD的催化活性。計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果表明，SARA結(jié)合在Cu/ZnSOD分子表面的V-Loop和GK2之間。SARA之所以未引起Cu/ZnSOD催化活性改變主要是由于SARA的結(jié)合位置距Cu/ZnSOD活性中心及活性中心通道較遠(yuǎn)，而SARA導(dǎo)致的Cu/ZnSOD二級(jí)結(jié)構(gòu)變化有限，因而沒(méi)有引起Cu/ZnSOD活性中心和活性中心通道結(jié)構(gòu)的變化。
　　3.考察了LOME、Cu2+單獨(dú)存在時(shí)及LOME與Cu2+共存時(shí)對(duì)CAT的復(fù)合毒性

9、作用及毒性機(jī)理，闡明了它們導(dǎo)致CAT催化活性改變的原因。LOME和Cu2+單獨(dú)存在時(shí)均能結(jié)合在CAT的芳香氨基酸附近并導(dǎo)致CAT的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其活性中心與鐵卟啉鄰近的氨基酸微環(huán)境的改變。當(dāng)LOME和Cu2+共存時(shí)對(duì)CAT的結(jié)構(gòu)影響程度大約相當(dāng)于兩者單獨(dú)作用之合。等溫微量熱滴定研究結(jié)果表明:與CAT相比，Cu2+更易于與LOME結(jié)合形成LOME-Cu2+復(fù)合物。當(dāng)LOME和Cu2+共同作用于CAT時(shí)，更傾向于以LOME-Cu2+復(fù)合物的形式

10、結(jié)合在CAT分子上且結(jié)合位置與Cu2+相同。光譜研究顯示，LOME單獨(dú)存在時(shí)及與Cu2+共存時(shí)在CAT分子中的結(jié)合位置不變。據(jù)此推測(cè)，LOME、Cu2+及LOME-Cu2+復(fù)合物在酶分子中的結(jié)合位置相同。通過(guò)檢測(cè)LOME、Cu2+單獨(dú)存在時(shí)及兩者共存時(shí)對(duì)CAT催化活性的影響發(fā)現(xiàn):LOME對(duì)CAT的活性有輕微抑制作用，而Cu2+則在濃度達(dá)到1×10-4mol L-1時(shí)對(duì)CAT產(chǎn)生了明顯的抑制作用，使CAT催化活性降為原來(lái)的約80％;當(dāng)保持

11、酶中的Cu2+濃度為1×10-4mol L-1時(shí)向體系中加入LOME，酶的催化活性進(jìn)一步降低，且酶活降低程度明顯高于同樣條件下LOME和Cu2+單獨(dú)作用于酶時(shí)產(chǎn)生的酶活降低程度之和，說(shuō)明LOME和Cu2+共存時(shí)會(huì)對(duì)CAT產(chǎn)生協(xié)同毒性作用。計(jì)算機(jī)模擬研究顯示:LOME(Cu2+)結(jié)合在CAT分子表層的β3、β4及α9之間的區(qū)域，它們導(dǎo)致CAT活性降低的主要原因應(yīng)該是通過(guò)改變CAT分子二級(jí)結(jié)構(gòu)從而影響了CAT活性中心的鐵卟啉近端的氨基酸殘基

12、TYR357和PRO335。LOME與Cu2+共存時(shí)對(duì)TYR357和PRO335微環(huán)境的改變產(chǎn)生了合力作用，應(yīng)該是它們對(duì)CAT活性產(chǎn)生了協(xié)同抑制作用的主要原因。
　　4.研究了LOME和Cu2+對(duì)Cu/ZnSOD的聯(lián)合毒性作用。光譜學(xué)研究顯示，LOME和Cu2+均能夠結(jié)合在Cu/ZnSOD的芳香氨基酸附近并不同程度的改變了Cu/ZnSOD的結(jié)構(gòu)。當(dāng)LOME與Cu2+共存時(shí)，LOME的結(jié)合位置不變，而且能夠和Cu2+以LOME-Cu

13、2+形式結(jié)合在Cu/ZnSOD上。它們對(duì)Cu/ZnSOD的二級(jí)結(jié)構(gòu)及絡(luò)氨酸微環(huán)境的影響程度大約相當(dāng)兩者單獨(dú)作用之合。通過(guò)檢測(cè)不同濃度LOME和Cu2+對(duì)Cu/ZnSOD的活性的影響發(fā)現(xiàn)，LOME對(duì)Cu/ZnSOD的催化活性無(wú)明顯改變，而Cu2+使Cu/ZnSOD的催化活性顯著增強(qiáng)。保持加入酶中的Cu2+濃度為5×10-5mol L-1，再向體系中加入不同濃度的LOME，酶的催化活性與Cu2+單獨(dú)存在時(shí)基本相同。這一現(xiàn)象說(shuō)明，Cu2+與L

14、OME共存時(shí)與它們單獨(dú)存在時(shí)對(duì)Cu/ZnSOD的催化活性的影響相同。計(jì)算機(jī)模擬研究表明:LOME結(jié)合在Cu/ZnSOD分子表面的V-Loop和GK2之間的區(qū)域，與SARA的結(jié)合區(qū)域相似。LOME未影響Cu/ZnSOD活性的原因也應(yīng)是距Cu/ZnSOD活性中心和活性通道較遠(yuǎn)。ITC研究顯示，Cu2+與Cu/ZnSOD的作用有3種變化趨勢(shì)，說(shuō)明Cu2+在Cu/ZnSOD分子上至少可以結(jié)合在三種微環(huán)境不同的區(qū)域。根據(jù)光譜研究結(jié)果，一部分Cu2

15、+應(yīng)與LOME結(jié)合在同一區(qū)域。因LOME不影響Cu2+對(duì)Cu/ZnSOD活性的增敏程度，可以推斷這部分Cu2+對(duì)Cu/ZnSOD活性的改變不起作用;Cu2+能夠使Cu/ZnSOD酶活性增強(qiáng)的原因可能是它在Cu/ZnSOD活性中心的結(jié)合。LOME的存在不影響這部分Cu2+與Cu/ZnSOD的結(jié)合應(yīng)該是LOME未改變Cu2+對(duì)Cu/ZnSOD活性增敏程度的另一原因。
　　5.建立了高靈敏檢測(cè)LOME和DANO的化學(xué)發(fā)光-酶聯(lián)免疫分析方

16、法。對(duì)包被抗原的度盤(pán)濃度、LOME和DANO抗體的稀釋倍數(shù)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗的稀釋倍數(shù)及酶標(biāo)板的種類等進(jìn)行了優(yōu)化。在優(yōu)化條件下，測(cè)得LOME的IC50值為0.22ppb，線性范圍為0.05-1.0ppb，檢測(cè)限為0.032ppb;測(cè)得DANO的IC50值為0.1ppb，線性范圍為0.025-0.5ppb，檢測(cè)限為0.017ppb。與使用相同抗體的普通酶聯(lián)免疫法相比，新建方法在靈敏度、特異性、線性范圍等方面均得到顯著提高。將

17、新建方法應(yīng)用于牛奶中LOME和DANO回收率的測(cè)定，LOME的批內(nèi)和批間回收率分別為:88.7％-103.4％和97.8％-107.2％，相應(yīng)變異系數(shù)分別為:6.3％-8.6％和2.4％-8.0％;DANO的批內(nèi)和批間回收率分別為:96.2％-105.2％和92.6％-101.2％，相應(yīng)變異系數(shù)分別為:2.4％-8.7％和2.6％-9.5％。說(shuō)明該方法是穩(wěn)定可靠的，有較高的應(yīng)用價(jià)值。
　　本文的研究結(jié)果為氟喹諾酮藥物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供

18、了新的依據(jù)，并為研究氟喹諾酮污染物與金屬離子的聯(lián)合毒性提供了值得借鑒的方法。我們的研究表明:由于作用機(jī)理不同，相同污染物對(duì)不同靶蛋白的毒性效應(yīng)可能存在顯著區(qū)別。特別是金屬離子的存在可能會(huì)大大增強(qiáng)氟喹諾酮污染物的毒性效應(yīng)，考察氟喹諾酮藥物的健康危害和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)時(shí)同時(shí)考慮共存金屬離子的影響十分重要。此外，我們建立的高靈敏檢測(cè)LOME和DANO的化學(xué)發(fā)光—酶聯(lián)免疫新方法，為檢測(cè)環(huán)境中LOME和DANO的污染狀況及進(jìn)一步研究LOME和DANO的細(xì)