重組酵母GS115-PSD、GS115-CEC的構(gòu)建及其對(duì)水果采后病害抑制效果的研究.pdf

1、由真菌病原菌引起的果實(shí)采后病害對(duì)人們?cè)斐闪藝?yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。用拮抗酵母取代化學(xué)殺菌劑，或降低化學(xué)殺菌劑的使用量(即生物防治BCPD)，具有良好的應(yīng)用前景，但是普通拮抗菌很難達(dá)到化學(xué)殺菌劑的殺菌效果，因而篩選新型拮抗菌或提高原有拮抗菌拮抗效力成為了該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。通過(guò)基因工程技術(shù)改造拮抗酵母從而提高其生防效果是果蔬采后病害生物防治的新方法。本文探討了將抗菌肽基因轉(zhuǎn)移到酵母中表達(dá)以提高其生防效果的方法，成功的將外源抗菌肽基因Cecropin

2、A和PsdI在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)并對(duì)重組酵母GS115/CEC、GS115/PSD的安全性及對(duì)果蔬采后的主要致病菌和果蔬真菌病原菌引起的腐爛的抑制效果進(jìn)行了研究：探討了該酵母與外源物質(zhì)結(jié)合使用對(duì)果蔬采后病害抑制效果的影響；初步研究了該酵母對(duì)果蔬致病菌的抑制機(jī)理及對(duì)果蔬貯藏后品質(zhì)的影響，其主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)根據(jù)已報(bào)道基因序列合成抗菌肽Cecropin A和PsdI基因片段，并將其連接到PGEM-T載體上。在此基礎(chǔ)上將

3、目的基因插入酵母表達(dá)載體pPIC9K，構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體。將其線性化后，用電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入Pichia Pastoris GS115中。采用G418進(jìn)行梯度篩選高抗性轉(zhuǎn)化子。以甲醇作為誘導(dǎo)物，取發(fā)酵培養(yǎng)3d后的發(fā)酵上清液，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE驗(yàn)證了基因表達(dá)的正確性。并且經(jīng)接種培養(yǎng)、誘導(dǎo)發(fā)酵及PCR鑒定等驗(yàn)證了重組酵母具有良好的穩(wěn)定性。
　　 (2)通過(guò)對(duì)重組畢赤酵母GS115/CEC、GS115/PSD發(fā)酵過(guò)程的兩

4、個(gè)階段發(fā)酵條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得出生長(zhǎng)階段優(yōu)化后的發(fā)酵工藝為：甘油2％，硫酸銨2％，pH=6.5-7.5，30℃條件下培養(yǎng)72h。外源基因誘導(dǎo)表達(dá)階段優(yōu)化后的發(fā)酵工藝為：甲醇1％，硫酸銨2％，pH=7.0，30℃條件下培養(yǎng)72h。采用正交實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)化畢赤酵母的發(fā)酵條件，其影響發(fā)酵的主要因素及影響的大小依次為：溫度>甲醇濃度>發(fā)酵天數(shù)>溶液pH值。最終得到重組畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程中各項(xiàng)影響因素的優(yōu)化值，即pH5.5，甲醇濃度為1％，溫度為30℃，時(shí)

5、間為4d，在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下，重組酵母GS115/CEC、GS115/PSD表達(dá)的外源蛋白含量平均可達(dá)15.1及11.3 mg/L。
　　 (3)利用重組酵母對(duì)4種果實(shí)的4種主要采后致病菌進(jìn)行了體外及體內(nèi)生防實(shí)驗(yàn)：平板抑菌實(shí)驗(yàn)及液體抑菌實(shí)驗(yàn)均表明重組酵母在體外對(duì)病原菌有廣譜抑菌活性；實(shí)驗(yàn)表明該重組酵母可顯著抑制鏈格孢、灰葡萄孢在番茄果實(shí)上的侵染；抑制擴(kuò)展青霉引起的蘋果及梨的腐爛；抑制灰葡萄孢引起的梨和蘋果腐爛。同時(shí)實(shí)驗(yàn)表明，重

6、組酵母對(duì)病原真菌的抑制效力與其細(xì)胞懸浮液的濃度有關(guān)，濃度越高，對(duì)致病菌的抑制作用也越強(qiáng)。
　　 (4)對(duì)重組酵母抑菌機(jī)理的研究結(jié)果表明，抑菌機(jī)制除體現(xiàn)了傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)與空間的競(jìng)爭(zhēng)外，采用掃描電鏡、透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)表達(dá)抗菌肽基因的重組酵母處理的真菌外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)都發(fā)生了很大的變化，出現(xiàn)了畸形，破裂，斷殘等現(xiàn)象。證實(shí)了其對(duì)真菌的膜結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的損壞作用。
　　 (5)在以上工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從分子水平研究了表達(dá)抗菌肽

7、基因的重組酵母對(duì)真菌的作用機(jī)制。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)證明，抗菌肽能與真菌的RNA結(jié)合，影響了它們?cè)陔娪局械倪w移率，同時(shí)還能使真菌的DNA及RNA降解，因而真菌細(xì)胞的代謝過(guò)程受到破壞，最終導(dǎo)致了真菌的死亡。此外，重組酵母能誘導(dǎo)與果實(shí)抗性相關(guān)的PR蛋白過(guò)量表達(dá)，因此誘導(dǎo)果實(shí)的自身抗性可能也是抑菌機(jī)制的一部分。
　　 (6)重組酵母能和外源物質(zhì)相結(jié)合，顯著增強(qiáng)對(duì)果實(shí)采后病害的防治效果：重組酵母和適當(dāng)濃度金屬鹽類(氯化鈣)、碳酸鹽及乙醇結(jié)合使用