具有微納交替結(jié)構(gòu)的多層支架對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響.pdf

1、雖然用于骨組織工程的支架繁多，但其各自均有不足之處，很難滿足目前對骨組織修復(fù)，替代，重建的要求。因此，制備生物相容性好，能夠模仿細(xì)胞外基質(zhì)，力學(xué)強(qiáng)度適宜，而且具有良好成骨作用的新型骨組織工程支架或者改性支架成為關(guān)鍵。在本論文中，基于目前骨組織工程存在的問題，制備了一種新型具有微納交替結(jié)構(gòu)的多層支架，通過向其中載入大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2），研究了該材料的成骨分化功能。
　　首先，我們利用

2、靜電紡絲技術(shù)制備了PCL納米纖維膜，并通過掃描電子顯微鏡(SEM)對其表面形貌和直徑大小進(jìn)行了表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纖維較光滑，呈無規(guī)分布，表面形貌良好，平均直徑為282 nm。接著，我們自行設(shè)計(jì)、裝配了微流控裝置，并利用微流控技術(shù)制備了海藻酸鈣水凝膠微球，通過體視顯微鏡，流變儀等對微球的表面形貌和流變性能進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，微球呈球形，大小均一，而且分散均勻。同時(shí)，確定了其粘彈性，也證明了該水凝膠的三維交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。之后，將靜電紡絲制備的

3、納米纖維膜和微流控制備的微球通過層層不斷疊加，最終得到一層纖維膜，一層微球的多層微納結(jié)構(gòu)支架。
　　其次，我們從大鼠脛腓骨中提取了原代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)，將其包裹進(jìn)海藻酸鈣微球中，利用活死細(xì)胞染色和Alamar blue法考察了微球包裹細(xì)胞的生存狀態(tài)和增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微球中的細(xì)胞大部分處于存活狀態(tài)，存活率較高(大于85％)。包裹的細(xì)胞與空白對照組相比，有較緩慢的增殖。接著，將干細(xì)胞和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2

4、)共同載入微球和微納結(jié)構(gòu)中，檢測其堿性磷酸酶（ALP）的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)含有BMP-2的微納結(jié)構(gòu)支架組在14和21天時(shí)，均具有最高的ALP表達(dá)量。通過茜素紅S(Alizarin Red S)染色定性和定量地考察了體外培養(yǎng)21天時(shí)鈣鹽的沉積。結(jié)果與21天時(shí)的ALP結(jié)果類似。
　　最后，我們進(jìn)行了體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)，將微納結(jié)構(gòu)支架植入到SD大鼠皮下，考察其異位成骨作用。在植入4周和8周后，利用組織學(xué)染色和免疫組化的方法，檢測了體內(nèi)異位成骨效果。

5、結(jié)果表明:植入支架8周后，根據(jù)H&E染色顯示，所有支架均有組織的長入。Masson染色表明，除了純微納結(jié)構(gòu)支架組外，含有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)或/和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）的微球支架和微納結(jié)構(gòu)支架均有類似骨組織結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。對骨鈣素的免疫組化結(jié)果表明，含有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)或/和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的微球支架和微納結(jié)構(gòu)支架確實(shí)呈現(xiàn)出陽性染色反應(yīng)，證明確實(shí)發(fā)生了異位成骨現(xiàn)象。綜上，說明了該新型微納