基于蛋白酶催化位點分離硫酸軟骨素與膠原蛋白.pdf

1、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)簡稱CS，在體內以蛋白多糖的形式存在于軟骨等組織基質中，與蛋白多糖中的核心蛋白以共價鍵相結合。硫酸軟骨素是一種酸性糖胺聚糖，由重復二糖單位的葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以β-1，4糖苷鍵連接而成。一般含有20～60個重復二糖，相對分子量為5000～50000Dal。硫酸軟骨素具有治療高血脂，心絞痛，改善血液供應、降低血清膽固醇、預防和治療關節(jié)畸形等多種藥理作用，因此廣泛應用于臨

2、床、醫(yī)藥、和保健食品等領域。
　　 本課題以清真屠宰場的新鮮牛喉骨軟骨為原料，以硫酸軟骨素的純度為主要考察指標，采用堿-單酶酶解法、堿-雙酶酶解法分離硫酸軟骨素與膠原蛋白。
　　 1.在堿-菠蘿蛋白酶酶解法中，首先以硫酸軟骨素的得率為主要的考察指標，優(yōu)化了堿提取法的生產工藝及參數(shù)。優(yōu)化工藝條件:提取溫度40℃，料液比為1∶7，提取時間2h，堿液濃度6％，然后優(yōu)化了菠蘿蛋白酶酶解工藝，優(yōu)化工藝條件:酶用量0.08％、pH值

3、6.0、酶解溫度40℃、酶解時間2h，產品的得率為18.56％，氨基己糖含量為28.13％，產品純度為79.32％。
　　 2.在堿-胰蛋白酶酶解法中，以硫酸軟骨素的純度為主要的考察指標，在堿提取的基礎上選擇胰蛋白酶（動物蛋白酶）進一步分離CS與膠原蛋白。優(yōu)化工藝條件:pH值9.0，酶用量0.09％，酶解溫度48℃、酶解時間2.5h，產品的得率為35.40％，氨基己糖含量為34.26％，產品純度為96.64％。
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4、.在堿-堿性蛋白酶酶解中，以硫酸軟骨素的純度為主要的考察指標，在堿提的基礎上選擇堿性蛋白酶進一步分離CS與膠原蛋白。優(yōu)化工藝條件:酶解時間2.0h、pH9.0、酶用量0.09％、酶解溫度52℃，CS產品的得率為35.56％，氨基己糖含量為34.88％，純度為98.36％。
　　 4.在堿-雙酶法酶解中，以硫酸軟骨素的純度為主要的考察指標，在堿提的基礎上，根據(jù)堿-單酶法試驗結果，進行雙酶復合提取硫酸軟骨素，其中堿性蛋白酶與胰蛋白酶

5、復合提取中復合酶配比為1∶0.6時，pH9.0，酶解溫度52℃，酶解時間2h，CS產品得率為30.28％，氨基己糖含量為33.74％，純度為95.15％。
　　 5.對硫酸軟骨素分離提取工藝優(yōu)化條件進行小試研究，主要是對試驗結果進行驗證及對比研究。根據(jù)國家藥典標準檢測產品的各項指標，如理化性質檢測和微生物檢測，其中堿-雙酶酶解法所分離提取CS產品純度最高，為94.32％，超出國家藥典標準(68％)及出口標準(84.6％)，而且C

6、S產品的其他指標也均符合國家藥典標準要求。
　　 6.采用超濾濃縮的方法，分離純化堿-單酶法及堿-雙酶法提取的硫酸軟骨素與膠原蛋白，然后測定用不同蛋白酶酶解法分離得到的膠原蛋白的分子量范圍及膠原蛋白含量。堿-菠蘿蛋白酶酶解法分離得到的蛋白含量為10.56g/L，堿-胰蛋白酶酶解法分離得到的蛋白含量為10.05g/L，堿-堿性蛋白酶酶解法分離得到的蛋白含量為9.02g/L，堿-雙酶酶解法分離得到的蛋白含量為9.90 g/L，經Tr