反義波形蛋白cDNA與硫酸軟骨素酶聯(lián)合干預對大鼠脊髓損傷修復的影響.pdf

1、目的:波形蛋白(vimentin,Vim)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是膠質(zhì)瘢痕主要構成細胞--反應性星形膠質(zhì)細胞(astrocyte)的中間絲蛋白。星形膠質(zhì)細胞反應性增生及Vim、GFAF的表達上調(diào)是反應性膠質(zhì)化及膠質(zhì)瘢痕形成的重要標志。作為重要的細胞骨架成分,Vim和GFAF的表達上調(diào)是膠質(zhì)瘢痕形成的關鍵因素。硫酸軟骨多糖蛋白(chondroitin sulphate

2、 proteoglycans,CSPGs)是中樞軸突再生重要的抑制分子,主要由反應性星形膠質(zhì)細胞分泌,是膠質(zhì)瘢痕細胞外基質(zhì)(extracellular element,ECM)的關鍵成分,主要由核心蛋白及糖基側(cè)鏈所構成。大量研究表明,硫酸軟骨素酶ABC(Chondroitinase ABC,ChABC)可以特異性消化CSPGs糖基側(cè)鏈,改變這種生物大分子的結構,去除其神經(jīng)再生抑制成分,從而促進軸突再生及大鼠行為學改善。盡管得到了大量實驗

3、證實,但單純應用ChABC對脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)的治療效果仍難盡人意。膠質(zhì)瘢痕的細胞成分及ECM共同構成了神經(jīng)再生的物理、化學屏障,而大量研究著眼于單純對瘢痕的細胞成分或細胞外抑制分子進行干預,鮮有實驗同時針對細胞內(nèi)、外兩種關鍵成分。聯(lián)合策略被認為是最有希望的SCI治療措施,本研究即利用大鼠脊銹半橫斷損傷模型,著眼于膠質(zhì)瘢痕構成的最關鍵構成細胞星形膠質(zhì)及其分泌的重要的細胞外抑制分子CSPGs,觀察大鼠

4、SCI后反應性星形膠質(zhì)細胞中間絲Vim、GFAP及胞外基質(zhì)CSPGs的表達變化,并擬通過聯(lián)合采用反義Vim cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及ChABC同時抑制細胞內(nèi)Vim的表達和去除細胞外CSPGs抑制成分,探討聯(lián)合干預細胞內(nèi)、外關鍵構成成分對大鼠SCI后膠質(zhì)瘢痕形成的影響,并觀察其對神經(jīng)再生及大鼠行為學的促進作用。
　　 方法:
　　 第一部分,利用大鼠T9-T10脊髓單側(cè)半橫斷缺損損傷模型,通過H.E.染色、RT-PCR、W

5、estem blot、免疫組織化學、免疫熒光、神經(jīng)示蹤等方法觀察SCI后損傷局部病理生理學變化,并利用該模型觀察脊髓局部聯(lián)合給予反義Vim cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒及ChABC聯(lián)合干預后Vim、GFAP及CSPGs表達的變化,研究聯(lián)合用藥對脊髓局部膠質(zhì)瘢痕及空洞形成的影響。
　　 第二部分,利用大鼠T9-T10脊髓背側(cè)半橫斷損傷模型,通過神經(jīng)束路追蹤,并結合免疫組織化學、免疫熒光等方法研究SCI后上行和下行神經(jīng)纖維的再生,并探討反義V

6、im cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒及ChABC聯(lián)合干預對SCI后神經(jīng)再生及行為學改變的影響。
　　 結果:
　　 1.正常大鼠脊髓Vim在mRNA及蛋白水平幾乎不表達,僅在白質(zhì)表面、極少量多突起膠質(zhì)細胞內(nèi)少量表達,脊髓中央管細胞明顯表達;GFAP在脊髓白質(zhì)及灰質(zhì)均有表達,白質(zhì)表面及中央管灰質(zhì)周圍表達稍高,GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞胞體較小,突起細小;CSPGs(以NG2為代表)在mRNA及蛋白水平未見明顯表達,CS-56(代表CSP

7、Gs)僅在白質(zhì)表面、灰質(zhì)前角神經(jīng)元周圍有極少量表達,在脊髓軟膜強烈表達。
　　 2.SCI后2w,脊髓損傷局部明顯縮窄變細,開始有空洞形成;Vim、GFAP及NG2 mRNA表達顯著上調(diào);損傷局部及其周圍Vim、GFAP表達明顯增加,大量Vim、GFAP陽性反應性星形膠質(zhì)細胞在損傷局部大量聚集,胞體增生、肥大,突起變粗變長,相互交織,形成網(wǎng)狀;損傷局部CSPGs在細胞外大量表達,較Vim、GFAP表達范圍相對局限。SCI后8 w

8、,損傷局部及其周圍Vim、GFAP表達增加更加明顯,大量Vim、GFAP陽性反應性星形膠質(zhì)細胞胞體及突起相互交織,構成致密膠質(zhì)瘢痕組織,與GFAP相比,Vim和CSPGs的表達更集中于損傷區(qū),與膠質(zhì)瘢痕的形成部位相一致,提示Vimentin和CSPGs可能是膠質(zhì)瘢痕更明顯的標志。
　　 3.SCI后2w,與生理鹽水組相比,反義Vim cDNA組及聯(lián)合組Vim、GFAP在mRNA及蛋白水平均明顯下調(diào),病毒空載體組及ChABC組表達

9、無明顯變化;與生理鹽水組相比,其它各組NG2(一種主要的CSPGs分子)mRNA均無明顯變化,ChABC組及聯(lián)合組CS-56(代表CSPGs)表達明顯下調(diào),病毒空載體組及反義Vim cDNA組無明顯變化;Western blot示SCI后2 w,ChABC組及聯(lián)合組286(可與CSPGs核心蛋白結合,但不與完整CSPGs分子結合)表達陽性,且兩組之間無明顯差異,而生理鹽水組、病毒空載體組及反義Vim cDNA.組未見陽性表達;生理鹽水組

10、蛋白提取物體外經(jīng)ChABC孵育后286表達明顯呈陽性,且強于ChABC組及聯(lián)合組286。SCI后8w,與生理鹽水組相比,反義Vim cDNA組及聯(lián)合組Vim、GFAP在mRNA及蛋白水平均明顯下調(diào),病毒空載體組及ChABC組表達無明顯變化;與生理鹽水組相比,ChABC組及聯(lián)合組CS-56(代表CSPGs)表達明顯下調(diào),病毒空載體組及反義VimcDNA組無明顯變化。多數(shù)SCI大鼠損傷區(qū)形成空洞,空洞壁由致密的膠質(zhì)瘢痕組織形成;SCI后8

11、w,與生理鹽水組相比,ChABC組、反義Vim cDNA組及聯(lián)合組空洞大小均明顯變小(p＜0.05),但三組相互之間無明顯差異,而病毒空載體組無明顯變化。
　　 4.免疫熒光三標示正常脊髓NF200在神經(jīng)元胞體及突起均有表達,其突起與星形膠質(zhì)細胞突起關系密切;SCI后8 w,生理鹽水組GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞及其突起相互交織,形成致密的膠質(zhì)瘢痕,構成空洞壁,神經(jīng)元NF200陽性突起可到達空洞壁外側(cè),但無法穿越致密的瘢痕區(qū)到達空洞

12、壁外側(cè);而聯(lián)合組空洞壁膠質(zhì)瘢痕GFAP表達明顯減少,GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞胞體較少,突起細小,排列較規(guī)則,神經(jīng)元NF200陽性突起可穿越薄層的瘢痕組織到達空洞壁的內(nèi)側(cè)。
　　 5.運動區(qū)皮層BDA順行示蹤示正常大鼠脊髓CST大部位于中央管背側(cè)后柱白質(zhì)的深部,左右兩側(cè)相鄰,呈對稱分布,其走行平直;極少量CST纖維位于脊髓側(cè)角及前角白質(zhì),走行亦平直:SCI后8 w,生理鹽水組CST在GFAP陽性膠質(zhì)瘢痕頭端停止,斷端可見典型的en

13、dbulbs,有少量纖維呈再生樣形態(tài),但未見陽性軸突越過瘢痕邊界進入膠質(zhì)瘢痕區(qū);聯(lián)合組CST亦在GFAP陽性膠質(zhì)瘢痕頭端停止,但endbulbs較少,可見較多BDA陽性軸突呈迂曲走行,從瘢痕邊緣進入GFAP陽性膠質(zhì)瘢痕區(qū),或從瘢痕邊緣與灰質(zhì)相臨處迂曲越過損傷區(qū),投射于損傷區(qū)下段,同時見少量BDA陽性突起自段端附近向灰質(zhì)走行,呈細小分枝狀。
　　 6.SCI損傷下端10 mm處HRP逆行示蹤示SCI后8 w,生理鹽水組損傷局部未見

14、陽性軸突越過瘢痕邊界進入膠質(zhì)瘢痕區(qū);而病毒組、酶組及聯(lián)合組均可見較多HRP陽性軸突呈迂曲走行,進入膠質(zhì)瘢痕區(qū),特別是聯(lián)合組HRP陽性纖維較病毒組及聯(lián)合組明顯增多。
　　 7.大鼠后肢運動功能BBB評分結果
　　 8.大鼠后肢Place反應結果
　　 結論:
　　 1.大鼠SCI后損傷區(qū)出現(xiàn)典型的反應性膠質(zhì)增生,局部形成膠質(zhì)瘢痕及空洞,且脊髓神經(jīng)傳導束所固有的分布特點使得大鼠SCI模型成為研究膠質(zhì)瘢痕及神經(jīng)

15、再生的理想模型;SCI后2 w,脊髓損傷區(qū)局部及其周圍Vim、GFAP在mRNA及蛋白水平表達均顯著上調(diào),同時損傷區(qū)CSPGs的mRNA及蛋白表達亦明顯增加,膠質(zhì)瘢痕及空洞初步形成:SCI后8 w,脊髓損傷區(qū)局部及其周圍Vim、GFAP表達增加更加顯著,CSPGs仍明顯表達,增生肥大的星形膠質(zhì)細胞胞體及突起及主要由其分泌的ECM成分共同形成致密的膠質(zhì)瘢痕,成為軸突再生的物理及化學屏障;膠質(zhì)瘢痕抑制了損傷后CST軸突的生長,CST停滯于瘢

16、痕區(qū)近端,不能進入或穿越瘢痕區(qū)到達脊髓損傷區(qū)的遠端。
　　 2.反義Vim eDNA可明顯抑制損傷區(qū)及其周圍至少3 mm范圍內(nèi)Vim、GFAP的表達,同時ChABC可部分去除膠質(zhì)瘢痕區(qū)CSPGs糖基側(cè)鏈成分,二者聯(lián)合應用抑制膠質(zhì)瘢痕的形成,同時促使空洞范圍縮小;故膠質(zhì)瘢痕的構成成分涉及以星形膠質(zhì)細胞為主的細胞成分及以CSPGs為代表的ECM成分。
　　 3.SCI后8 w,BDA標記CST神經(jīng)軸突停滯于損傷區(qū)頭端膠質(zhì)瘢痕

17、處,但軸突不能進入膠質(zhì)瘢痕區(qū)或損傷區(qū)遠端;反義Vim cDNA及ChABC聯(lián)合干預,可促使CST呈迂曲走行,進入或穿越膠質(zhì)瘢痕區(qū),甚至到達損傷區(qū)遠端,軸突末端呈現(xiàn)典型的再生形態(tài),并可促進HRP陽性纖維進入膠質(zhì)瘢痕區(qū),從而促進上行及下行神經(jīng)軸突再生。
　　 4.SCI后8 w,反義Vim cDNA及ChABC聯(lián)合干預可促使大鼠后肢運動功能評分和后肢撐趾反應恢復及趾間距增加,從而促進大鼠行為學改善;從部分行為學指標看,聯(lián)合策略對大鼠