反義波形蛋白cDNA與硫酸軟骨素酶聯(lián)合干預(yù)對(duì)大鼠脊髓損傷修復(fù)的影響.pdf

1、目的:波形蛋白(vimentin,Vim)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是膠質(zhì)瘢痕主要構(gòu)成細(xì)胞--反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte)的中間絲蛋白。星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生及Vim、GFAF的表達(dá)上調(diào)是反應(yīng)性膠質(zhì)化及膠質(zhì)瘢痕形成的重要標(biāo)志。作為重要的細(xì)胞骨架成分,Vim和GFAF的表達(dá)上調(diào)是膠質(zhì)瘢痕形成的關(guān)鍵因素。硫酸軟骨多糖蛋白(chondroitin sulphate

2、 proteoglycans,CSPGs)是中樞軸突再生重要的抑制分子,主要由反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌,是膠質(zhì)瘢痕細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular element,ECM)的關(guān)鍵成分,主要由核心蛋白及糖基側(cè)鏈所構(gòu)成。大量研究表明,硫酸軟骨素酶ABC(Chondroitinase ABC,ChABC)可以特異性消化CSPGs糖基側(cè)鏈,改變這種生物大分子的結(jié)構(gòu),去除其神經(jīng)再生抑制成分,從而促進(jìn)軸突再生及大鼠行為學(xué)改善。盡管得到了大量實(shí)驗(yàn)

3、證實(shí),但單純應(yīng)用ChABC對(duì)脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)的治療效果仍難盡人意。膠質(zhì)瘢痕的細(xì)胞成分及ECM共同構(gòu)成了神經(jīng)再生的物理、化學(xué)屏障,而大量研究著眼于單純對(duì)瘢痕的細(xì)胞成分或細(xì)胞外抑制分子進(jìn)行干預(yù),鮮有實(shí)驗(yàn)同時(shí)針對(duì)細(xì)胞內(nèi)、外兩種關(guān)鍵成分。聯(lián)合策略被認(rèn)為是最有希望的SCI治療措施,本研究即利用大鼠脊銹半橫斷損傷模型,著眼于膠質(zhì)瘢痕構(gòu)成的最關(guān)鍵構(gòu)成細(xì)胞星形膠質(zhì)及其分泌的重要的細(xì)胞外抑制分子CSPGs,觀察大鼠

4、SCI后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中間絲Vim、GFAP及胞外基質(zhì)CSPGs的表達(dá)變化,并擬通過聯(lián)合采用反義Vim cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及ChABC同時(shí)抑制細(xì)胞內(nèi)Vim的表達(dá)和去除細(xì)胞外CSPGs抑制成分,探討聯(lián)合干預(yù)細(xì)胞內(nèi)、外關(guān)鍵構(gòu)成成分對(duì)大鼠SCI后膠質(zhì)瘢痕形成的影響,并觀察其對(duì)神經(jīng)再生及大鼠行為學(xué)的促進(jìn)作用。
　　 方法:
　　 第一部分,利用大鼠T9-T10脊髓單側(cè)半橫斷缺損損傷模型,通過H.E.染色、RT-PCR、W

5、estem blot、免疫組織化學(xué)、免疫熒光、神經(jīng)示蹤等方法觀察SCI后損傷局部病理生理學(xué)變化,并利用該模型觀察脊髓局部聯(lián)合給予反義Vim cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒及ChABC聯(lián)合干預(yù)后Vim、GFAP及CSPGs表達(dá)的變化,研究聯(lián)合用藥對(duì)脊髓局部膠質(zhì)瘢痕及空洞形成的影響。
　　 第二部分,利用大鼠T9-T10脊髓背側(cè)半橫斷損傷模型,通過神經(jīng)束路追蹤,并結(jié)合免疫組織化學(xué)、免疫熒光等方法研究SCI后上行和下行神經(jīng)纖維的再生,并探討反義V

6、im cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒及ChABC聯(lián)合干預(yù)對(duì)SCI后神經(jīng)再生及行為學(xué)改變的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.正常大鼠脊髓Vim在mRNA及蛋白水平幾乎不表達(dá),僅在白質(zhì)表面、極少量多突起膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)少量表達(dá),脊髓中央管細(xì)胞明顯表達(dá);GFAP在脊髓白質(zhì)及灰質(zhì)均有表達(dá),白質(zhì)表面及中央管灰質(zhì)周圍表達(dá)稍高,GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體較小,突起細(xì)小;CSPGs(以NG2為代表)在mRNA及蛋白水平未見明顯表達(dá),CS-56(代表CSP

7、Gs)僅在白質(zhì)表面、灰質(zhì)前角神經(jīng)元周圍有極少量表達(dá),在脊髓軟膜強(qiáng)烈表達(dá)。
　　 2.SCI后2w,脊髓損傷局部明顯縮窄變細(xì),開始有空洞形成;Vim、GFAP及NG2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào);損傷局部及其周圍Vim、GFAP表達(dá)明顯增加,大量Vim、GFAP陽性反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞在損傷局部大量聚集,胞體增生、肥大,突起變粗變長(zhǎng),相互交織,形成網(wǎng)狀;損傷局部CSPGs在細(xì)胞外大量表達(dá),較Vim、GFAP表達(dá)范圍相對(duì)局限。SCI后8 w

8、,損傷局部及其周圍Vim、GFAP表達(dá)增加更加明顯,大量Vim、GFAP陽性反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體及突起相互交織,構(gòu)成致密膠質(zhì)瘢痕組織,與GFAP相比,Vim和CSPGs的表達(dá)更集中于損傷區(qū),與膠質(zhì)瘢痕的形成部位相一致,提示Vimentin和CSPGs可能是膠質(zhì)瘢痕更明顯的標(biāo)志。
　　 3.SCI后2w,與生理鹽水組相比,反義Vim cDNA組及聯(lián)合組Vim、GFAP在mRNA及蛋白水平均明顯下調(diào),病毒空載體組及ChABC組表達(dá)

9、無明顯變化;與生理鹽水組相比,其它各組NG2(一種主要的CSPGs分子)mRNA均無明顯變化,ChABC組及聯(lián)合組CS-56(代表CSPGs)表達(dá)明顯下調(diào),病毒空載體組及反義Vim cDNA組無明顯變化;Western blot示SCI后2 w,ChABC組及聯(lián)合組286(可與CSPGs核心蛋白結(jié)合,但不與完整CSPGs分子結(jié)合)表達(dá)陽性,且兩組之間無明顯差異,而生理鹽水組、病毒空載體組及反義Vim cDNA.組未見陽性表達(dá);生理鹽水組

10、蛋白提取物體外經(jīng)ChABC孵育后286表達(dá)明顯呈陽性,且強(qiáng)于ChABC組及聯(lián)合組286。SCI后8w,與生理鹽水組相比,反義Vim cDNA組及聯(lián)合組Vim、GFAP在mRNA及蛋白水平均明顯下調(diào),病毒空載體組及ChABC組表達(dá)無明顯變化;與生理鹽水組相比,ChABC組及聯(lián)合組CS-56(代表CSPGs)表達(dá)明顯下調(diào),病毒空載體組及反義VimcDNA組無明顯變化。多數(shù)SCI大鼠損傷區(qū)形成空洞,空洞壁由致密的膠質(zhì)瘢痕組織形成;SCI后8

11、w,與生理鹽水組相比,ChABC組、反義Vim cDNA組及聯(lián)合組空洞大小均明顯變小(p＜0.05),但三組相互之間無明顯差異,而病毒空載體組無明顯變化。
　　 4.免疫熒光三標(biāo)示正常脊髓NF200在神經(jīng)元胞體及突起均有表達(dá),其突起與星形膠質(zhì)細(xì)胞突起關(guān)系密切;SCI后8 w,生理鹽水組GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞及其突起相互交織,形成致密的膠質(zhì)瘢痕,構(gòu)成空洞壁,神經(jīng)元NF200陽性突起可到達(dá)空洞壁外側(cè),但無法穿越致密的瘢痕區(qū)到達(dá)空洞

12、壁外側(cè);而聯(lián)合組空洞壁膠質(zhì)瘢痕GFAP表達(dá)明顯減少,GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體較少,突起細(xì)小,排列較規(guī)則,神經(jīng)元NF200陽性突起可穿越薄層的瘢痕組織到達(dá)空洞壁的內(nèi)側(cè)。
　　 5.運(yùn)動(dòng)區(qū)皮層BDA順行示蹤示正常大鼠脊髓CST大部位于中央管背側(cè)后柱白質(zhì)的深部,左右兩側(cè)相鄰,呈對(duì)稱分布,其走行平直;極少量CST纖維位于脊髓側(cè)角及前角白質(zhì),走行亦平直:SCI后8 w,生理鹽水組CST在GFAP陽性膠質(zhì)瘢痕頭端停止,斷端可見典型的en

13、dbulbs,有少量纖維呈再生樣形態(tài),但未見陽性軸突越過瘢痕邊界進(jìn)入膠質(zhì)瘢痕區(qū);聯(lián)合組CST亦在GFAP陽性膠質(zhì)瘢痕頭端停止,但endbulbs較少,可見較多BDA陽性軸突呈迂曲走行,從瘢痕邊緣進(jìn)入GFAP陽性膠質(zhì)瘢痕區(qū),或從瘢痕邊緣與灰質(zhì)相臨處迂曲越過損傷區(qū),投射于損傷區(qū)下段,同時(shí)見少量BDA陽性突起自段端附近向灰質(zhì)走行,呈細(xì)小分枝狀。
　　 6.SCI損傷下端10 mm處HRP逆行示蹤示SCI后8 w,生理鹽水組損傷局部未見

14、陽性軸突越過瘢痕邊界進(jìn)入膠質(zhì)瘢痕區(qū);而病毒組、酶組及聯(lián)合組均可見較多HRP陽性軸突呈迂曲走行,進(jìn)入膠質(zhì)瘢痕區(qū),特別是聯(lián)合組HRP陽性纖維較病毒組及聯(lián)合組明顯增多。
　　 7.大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分結(jié)果
　　 8.大鼠后肢Place反應(yīng)結(jié)果
　　 結(jié)論:
　　 1.大鼠SCI后損傷區(qū)出現(xiàn)典型的反應(yīng)性膠質(zhì)增生,局部形成膠質(zhì)瘢痕及空洞,且脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)束所固有的分布特點(diǎn)使得大鼠SCI模型成為研究膠質(zhì)瘢痕及神經(jīng)

15、再生的理想模型;SCI后2 w,脊髓損傷區(qū)局部及其周圍Vim、GFAP在mRNA及蛋白水平表達(dá)均顯著上調(diào),同時(shí)損傷區(qū)CSPGs的mRNA及蛋白表達(dá)亦明顯增加,膠質(zhì)瘢痕及空洞初步形成:SCI后8 w,脊髓損傷區(qū)局部及其周圍Vim、GFAP表達(dá)增加更加顯著,CSPGs仍明顯表達(dá),增生肥大的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體及突起及主要由其分泌的ECM成分共同形成致密的膠質(zhì)瘢痕,成為軸突再生的物理及化學(xué)屏障;膠質(zhì)瘢痕抑制了損傷后CST軸突的生長(zhǎng),CST停滯于瘢

16、痕區(qū)近端,不能進(jìn)入或穿越瘢痕區(qū)到達(dá)脊髓損傷區(qū)的遠(yuǎn)端。
　　 2.反義Vim eDNA可明顯抑制損傷區(qū)及其周圍至少3 mm范圍內(nèi)Vim、GFAP的表達(dá),同時(shí)ChABC可部分去除膠質(zhì)瘢痕區(qū)CSPGs糖基側(cè)鏈成分,二者聯(lián)合應(yīng)用抑制膠質(zhì)瘢痕的形成,同時(shí)促使空洞范圍縮小;故膠質(zhì)瘢痕的構(gòu)成成分涉及以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主的細(xì)胞成分及以CSPGs為代表的ECM成分。
　　 3.SCI后8 w,BDA標(biāo)記CST神經(jīng)軸突停滯于損傷區(qū)頭端膠質(zhì)瘢痕

17、處,但軸突不能進(jìn)入膠質(zhì)瘢痕區(qū)或損傷區(qū)遠(yuǎn)端;反義Vim cDNA及ChABC聯(lián)合干預(yù),可促使CST呈迂曲走行,進(jìn)入或穿越膠質(zhì)瘢痕區(qū),甚至到達(dá)損傷區(qū)遠(yuǎn)端,軸突末端呈現(xiàn)典型的再生形態(tài),并可促進(jìn)HRP陽性纖維進(jìn)入膠質(zhì)瘢痕區(qū),從而促進(jìn)上行及下行神經(jīng)軸突再生。
　　 4.SCI后8 w,反義Vim cDNA及ChABC聯(lián)合干預(yù)可促使大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分和后肢撐趾反應(yīng)恢復(fù)及趾間距增加,從而促進(jìn)大鼠行為學(xué)改善;從部分行為學(xué)指標(biāo)看,聯(lián)合策略對(duì)大鼠