硫酸軟骨素酶ABC聯(lián)合骨髓間質(zhì)充干細(xì)胞對(duì)大鼠脊髓損傷修復(fù)作用的研究.pdf

1、[目的]建立大鼠脊髓右側(cè)半橫斷損傷模型，通過(guò)大鼠側(cè)腦室置管途徑聯(lián)合應(yīng)用硫酸軟骨素酶ABC(ChABC)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)治療脊髓損傷，分析評(píng)價(jià)側(cè)腦室途徑給藥方法的可靠性以及ChABC和BMSCs聯(lián)合應(yīng)用在治療脊髓損傷后可能的作用機(jī)制。
　　[方法]密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞于移植前通過(guò)DAPL進(jìn)行標(biāo)記，調(diào)整細(xì)胞濃度備用。雄性Sprague-Dawley大鼠120只，建立右側(cè)腦室置管及右

2、側(cè)第10胸節(jié)脊髓半橫斷損傷模型，然后隨機(jī)分為4組：損傷組(A)，BMSCs移植治療組(B)，ChABC治療組(C)及ChABC和BMSCs聯(lián)合治療組(D)，每組30只。其中依據(jù)取材時(shí)間點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶、B、C、D各組大鼠再隨機(jī)分為術(shù)后第3天、第7天、第14天、第21天、第30天以及BDA示蹤六個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只(n=5)。A組于損傷后即通過(guò)留置管給予6μlPBS，以后每?jī)商煲淮?，?次；B組于損傷后第6天通過(guò)側(cè)腦室留置管給予含有BMS

3、Cs的PBS(5×107cells/ml)懸液30μl；C組于損傷后即經(jīng)留置管給予6μlCBABC(100U/ml)，以后每?jī)商煲淮?，?次；D組聯(lián)合應(yīng)用上述ChABC和BMSCs，給藥途徑、劑量及時(shí)程與上述單獨(dú)使用時(shí)相同。各時(shí)間點(diǎn)采用BBB評(píng)分法觀察大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能情況，然后取材固定以HE染色觀察脊髓組織形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)各組脊髓損傷區(qū)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(GAP-43)與神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的變化情況。術(shù)后第1

4、4天BDA示蹤亞組大鼠(n=5)行BDA順行示蹤染色。
　　[結(jié)果]
　　1.脊髓損傷后各組大鼠均出現(xiàn)典型右后肢癱瘓，損傷后第3天A、B、C、D四組間BBB評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；損傷后第7、14、21天，B、C、D三組與A組間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，D組與B、C組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　2.HE染色結(jié)果顯示脊髓傷后A組大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞大量增生，膠質(zhì)瘢痕及空洞形成，B、C、D三組損

5、傷后膠質(zhì)瘢痕均比A組少。脊髓傷后第21天，A組可見(jiàn)膠質(zhì)瘢痕面積明顯擴(kuò)大，組織結(jié)構(gòu)紊亂且不連續(xù)；B組空洞不再繼續(xù)擴(kuò)大并有縮小趨勢(shì)，可見(jiàn)少量膠質(zhì)瘢痕填充在斷端；C組頭側(cè)與尾側(cè)有少量白質(zhì)穿過(guò)損傷區(qū)相接觸，瘢痕區(qū)域明顯減小；D組神經(jīng)元形態(tài)改善，鄰近脊髓空洞范圍明顯縮小，組織結(jié)構(gòu)連續(xù)。
　　3.將DAPI標(biāo)記的BMSCs經(jīng)大鼠側(cè)腦途徑移植，各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)脊髓損傷部位均可見(jiàn)帶有藍(lán)色熒光標(biāo)記的BMSCs。D組術(shù)后第21天在脊髓損傷部位仍可見(jiàn)

6、大量陽(yáng)性標(biāo)記的BMSCs細(xì)胞存活。
　　4.損傷后第21天B、C和D三治療組的GAP-43陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多且染色深；損傷后第14、21、30天時(shí)，B、C、D三組與A組間損傷區(qū)GAP-43陽(yáng)性細(xì)胞百分率有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，B和D組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，B、D兩組與C組間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；
　　5.各組脊髓損傷后損傷區(qū)GAFP表達(dá)均隨時(shí)間發(fā)展逐漸增強(qiáng)，第14天達(dá)到高峰。損傷

7、后第7，14，21、30天，B、D兩組與A組的GFAP染色陽(yáng)性面積比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；C組與A組比較，僅第21天有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義(P<0.01)。損傷后第7，14，21天，D組與B組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)
　　6.BDA注射后2周鏡下觀察結(jié)果顯示，A組損傷平面以下BDA陽(yáng)性神經(jīng)纖維最少，B、C組有部分神經(jīng)纖維通過(guò)損傷平面向下傳導(dǎo)，D組BDA陽(yáng)性神經(jīng)纖維通過(guò)損傷平面數(shù)量最多。定量分析顯示D組與其余各組比

8、較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，B、C與A組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B和C組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　[結(jié)論]
　　1.大鼠側(cè)腦室留置導(dǎo)管給藥途徑安全穩(wěn)定，移植細(xì)胞及藥物通過(guò)腦脊液循環(huán)能有效到達(dá)脊髓損傷處，BMSCs存活率高。此法適合長(zhǎng)時(shí)間多次藥物干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究，可避免多次麻醉帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)和影響。
　　2.大鼠脊髓損傷后ChABC可以有效分解CSPGs，抑制損傷部位膠質(zhì)瘢痕形成

9、，為軸突再生提供有利微環(huán)境，從而間接促進(jìn)軸突再生。
　　3.聯(lián)合應(yīng)用ChABC與BMSCs可上調(diào)GAP-43的表達(dá)，改善受損神經(jīng)元形態(tài)，從而對(duì)脊髓損傷后軸突再生起到促進(jìn)作用
　　4.脊髓損傷后GFAP表達(dá)增加，聯(lián)合應(yīng)用ChABC和BMSCs能夠相互協(xié)同，可明顯抑制膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生，從而抑制GFAP的表達(dá)，同時(shí)ChABC能有效降解脊髓損傷區(qū)膠質(zhì)瘢痕，延長(zhǎng)移植細(xì)胞BMSCs的修復(fù)作用時(shí)間，明顯促進(jìn)神經(jīng)軸突再生，改善脊髓損傷后