硫酸軟骨素酶ABC聯(lián)合骨髓間質充干細胞對大鼠脊髓損傷修復作用的研究.pdf

1、[目的]建立大鼠脊髓右側半橫斷損傷模型，通過大鼠側腦室置管途徑聯(lián)合應用硫酸軟骨素酶ABC(ChABC)和骨髓間充質干細胞(BMSCs)治療脊髓損傷，分析評價側腦室途徑給藥方法的可靠性以及ChABC和BMSCs聯(lián)合應用在治療脊髓損傷后可能的作用機制。
　　[方法]密度梯度離心法結合貼壁篩選法分離大鼠骨髓間充質干細胞，細胞于移植前通過DAPL進行標記，調整細胞濃度備用。雄性Sprague-Dawley大鼠120只，建立右側腦室置管及右

2、側第10胸節(jié)脊髓半橫斷損傷模型，然后隨機分為4組：損傷組(A)，BMSCs移植治療組(B)，ChABC治療組(C)及ChABC和BMSCs聯(lián)合治療組(D)，每組30只。其中依據(jù)取材時間點及實驗目的將A、B、C、D各組大鼠再隨機分為術后第3天、第7天、第14天、第21天、第30天以及BDA示蹤六個亞組，每個亞組5只(n=5)。A組于損傷后即通過留置管給予6μlPBS，以后每兩天一次，共6次；B組于損傷后第6天通過側腦室留置管給予含有BMS

3、Cs的PBS(5×107cells/ml)懸液30μl；C組于損傷后即經(jīng)留置管給予6μlCBABC(100U/ml)，以后每兩天一次，共6次；D組聯(lián)合應用上述ChABC和BMSCs，給藥途徑、劑量及時程與上述單獨使用時相同。各時間點采用BBB評分法觀察大鼠后肢運動功能情況，然后取材固定以HE染色觀察脊髓組織形態(tài)學變化，應用免疫組化方法檢測各組脊髓損傷區(qū)生長相關蛋白43(GAP-43)與神經(jīng)膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的變化情況。術后第1

4、4天BDA示蹤亞組大鼠(n=5)行BDA順行示蹤染色。
　　[結果]
　　1.脊髓損傷后各組大鼠均出現(xiàn)典型右后肢癱瘓，損傷后第3天A、B、C、D四組間BBB評分無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；損傷后第7、14、21天，B、C、D三組與A組間有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.01)，D組與B、C組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　2.HE染色結果顯示脊髓傷后A組大鼠脊髓星形膠質細胞大量增生，膠質瘢痕及空洞形成，B、C、D三組損

5、傷后膠質瘢痕均比A組少。脊髓傷后第21天，A組可見膠質瘢痕面積明顯擴大，組織結構紊亂且不連續(xù)；B組空洞不再繼續(xù)擴大并有縮小趨勢，可見少量膠質瘢痕填充在斷端；C組頭側與尾側有少量白質穿過損傷區(qū)相接觸，瘢痕區(qū)域明顯減小；D組神經(jīng)元形態(tài)改善，鄰近脊髓空洞范圍明顯縮小，組織結構連續(xù)。
　　3.將DAPI標記的BMSCs經(jīng)大鼠側腦途徑移植，各組大鼠不同時間點脊髓損傷部位均可見帶有藍色熒光標記的BMSCs。D組術后第21天在脊髓損傷部位仍可見

6、大量陽性標記的BMSCs細胞存活。
　　4.損傷后第21天B、C和D三治療組的GAP-43陽性細胞數(shù)達到高峰，陽性細胞數(shù)多且染色深；損傷后第14、21、30天時，B、C、D三組與A組間損傷區(qū)GAP-43陽性細胞百分率有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.01)，B和D組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，B、D兩組與C組間有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.01)；
　　5.各組脊髓損傷后損傷區(qū)GAFP表達均隨時間發(fā)展逐漸增強，第14天達到高峰。損傷

7、后第7，14，21、30天，B、D兩組與A組的GFAP染色陽性面積比較，有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)；C組與A組比較，僅第21天有統(tǒng)計學差異意義(P<0.01)。損傷后第7，14，21天，D組與B組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)
　　6.BDA注射后2周鏡下觀察結果顯示，A組損傷平面以下BDA陽性神經(jīng)纖維最少，B、C組有部分神經(jīng)纖維通過損傷平面向下傳導，D組BDA陽性神經(jīng)纖維通過損傷平面數(shù)量最多。定量分析顯示D組與其余各組比

8、較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，B、C與A組比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，B和C組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　[結論]
　　1.大鼠側腦室留置導管給藥途徑安全穩(wěn)定，移植細胞及藥物通過腦脊液循環(huán)能有效到達脊髓損傷處，BMSCs存活率高。此法適合長時間多次藥物干預的實驗研究，可避免多次麻醉帶來的風險和影響。
　　2.大鼠脊髓損傷后ChABC可以有效分解CSPGs，抑制損傷部位膠質瘢痕形成

9、，為軸突再生提供有利微環(huán)境，從而間接促進軸突再生。
　　3.聯(lián)合應用ChABC與BMSCs可上調GAP-43的表達，改善受損神經(jīng)元形態(tài)，從而對脊髓損傷后軸突再生起到促進作用
　　4.脊髓損傷后GFAP表達增加，聯(lián)合應用ChABC和BMSCs能夠相互協(xié)同，可明顯抑制膠質細胞的反應性增生，從而抑制GFAP的表達，同時ChABC能有效降解脊髓損傷區(qū)膠質瘢痕，延長移植細胞BMSCs的修復作用時間，明顯促進神經(jīng)軸突再生，改善脊髓損傷后