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1、水產(chǎn)品中獸藥殘留問題日益突出,獸藥雖在養(yǎng)殖過程中帶來不少作用,但攝入人體后對(duì)人體危害大,嚴(yán)格把控水產(chǎn)品中的獸藥殘留就顯得尤為重要。恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)是第三代喹諾酮類藥物,由于其在組織液中濃度達(dá)到最高值速度快、組織分布范圍廣、抑菌的數(shù)量和種類多等諸多優(yōu)點(diǎn),且其代謝產(chǎn)物均有良好的抗菌作用,所以廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的疾病防治。由于部分養(yǎng)殖戶存在不規(guī)范用藥,容易導(dǎo)致恩諾沙星隨著食物鏈進(jìn)入人體,造成軟骨組織、中樞神經(jīng)、消
2、化系統(tǒng)等方面的損傷,同時(shí)較大劑量還會(huì)造成神經(jīng)系統(tǒng)的遲緩、肝臟損傷及皮膚過敏等個(gè)方面的問題。
本文通過采用膠體金免疫檢測(cè)法,研究適用于現(xiàn)場(chǎng)快速監(jiān)測(cè)水產(chǎn)品中ENR殘留的檢測(cè)體系。膠體金免疫層析法具有檢測(cè)速度快、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),非常適用于這類現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。本次研究主要獲得以下結(jié)果:
1.ENR-OVA人工抗原的合成。采用N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法將ENR偶聯(lián)到OVA上,經(jīng)FPLC、紫外、SDS-PAGE電泳等的檢測(cè)分析
3、,ENR與OVA偶聯(lián)成功,可以用于進(jìn)一步試驗(yàn);
2.多克隆抗體的制備。利用人工合成的抗原ENR-OVA免疫新西蘭大白兔,抗血清經(jīng)飽和硫酸銨法純化后,用ELISA間接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)得效價(jià)在1∶8000~1∶64000。其中以1號(hào)兔子的抗血清效果較佳,在此基礎(chǔ)上建立的ELISA間接競(jìng)爭(zhēng)法,檢測(cè)ENR濃度在0.1~8.1ng/mL之間,以結(jié)合率B/B0值為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)作曲線,通過擬合曲線獲得方程:y=-40.613 lg(x
4、)+58.963,R2=0.9959,IC50為1.662。
3.膠體金制備。采用Frens法制備出20 nm左右的膠體金顆粒,用K2CO3調(diào)pH到8.2,然后逐滴加入2 mL0.1 mg/mL的ENR-PcAb溶液,用BSA封閉,采用高速離心法純化,最終獲得深紅色膠體金溶液。
4.試紙條制備工藝確定。膠體金標(biāo)記恩諾沙星多克隆抗體噴膜量為65μL/cm2;Millipore的M180 NC膜;檢測(cè)線和質(zhì)控線(劃膜量均
5、為1.0μL/cm);ENR-OVA和羊抗兔IgG包被濃度均為1000 mg/L;樣品墊前處理,用含1% PVP的0.01 mol/L PBS(pH7.5)。采用此工藝制備出的試紙條最低檢測(cè)限可低至0.9ng/mL,在蝦和魚組織中肉眼最低檢測(cè)限分別為5 ng/g、10 ng/g。與ELISA間接競(jìng)爭(zhēng)法比對(duì)中,試紙條對(duì)蝦、魚中ENR濃度分別大于5 ng/mL、10 ng/mL的樣本,均能有效檢出陽性,而低于該值時(shí)顯色為陰性。試紙條在常溫干
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