缺血再灌注損傷與細胞凋亡在早期壓瘡中作用的初步探討.pdf

1、壓瘡(PressureUlcer，PU)是臨床常見的并發(fā)癥之一，其形成是多因素參與的復雜過程。缺血再灌注損傷機制被認為是壓瘡發(fā)生的重要機制，該機制在心、腦等組織器官的研究中較為深入，可為壓瘡研究借鑒。本研究試圖通過早期壓瘡動物模型初步探討缺血再灌注損傷相關機制與細胞凋亡在早期壓瘡形成中的作用。全文主要包括以下兩部分：第一部分，通過預實驗建立早期壓瘡動物模型；第二部分，在成功建模的基礎上探討缺血再灌注損傷引起的代謝變化和細胞凋亡在早期壓瘡

2、形成中的作用。
　　 目的：(1)通過文獻研究結合壓瘡發(fā)生背景建立符合實驗目的的早期壓瘡動物模型，并摸索該模型的最適壓強值：(2)通過檢測受壓肌組織中MPO、MDA含量，三種ATP酶活性，蘭尼定受體-1mRNA(RyR1mRNA)及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達的變化.探討缺血再灌注損傷引起的代謝變化與細胞凋亡在早期壓瘡形成中的作用及其關系的研究，以期為早期壓瘡的干預研究提供可參考的分子靶點。
　　 方法：第一部分：

3、48只SD雄性大鼠隨機均分為6組，每組各8只，均行10％水合氯醛麻醉后對照組不予以壓力；實驗組A-E組采用特制壓力裝置對大鼠股薄肌處進行施壓。A組予以100mmHg(13.73kPa)壓強；B組予以150mmHg(19.97kPa)壓強；C組予以170mmHg(22.47kPa)壓強；D組予以220mmHg(28.71kPa)壓強；E組予以270mmHg(34.96kPa)壓強。五組均經歷同等時間的缺血-再灌注循環(huán)(即3個循環(huán)的I/R，

4、I=缺血2h,R=再灌注0.5h)。實驗終點，肉眼觀察大鼠受壓部位皮膚顏色和形態(tài)變化，采集受壓組織中心標本后所有大鼠給予安樂死。通過肉眼觀察結果，光鏡下皮膚、肌肉組織病理學變化分析，并用酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測受壓肌組織中髓過氧化物酶(MPO)含量的變化以檢驗模型并找尋該模型的最適壓強值。
　　 第二部分：在第一部分實驗基礎上，將36只SD大鼠隨機均分為三組各12只，均行10％水合氯醛麻醉后，利用最適壓強值170mmH

5、g(22.47kPa)，對照組不予以壓力；實驗A、B兩組給予大鼠股薄肌處同一壓強170mmHg但不同壓力循環(huán)施壓。A組予以3個缺血-再灌注循環(huán)(3I/R,I=缺血2.0h,R=再灌注0.5h)，B組給予5個I/R。各組動物于相應的實驗終點，采集受壓組織中心標本后所有大鼠給予安樂死。通過常規(guī)石蠟切片、HE染色、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、比色法、real-timeRT-PCR、SP法免疫組織化學染色、TUNEL技術分別檢測各組肌組織中

6、髓過氧化物酶(MPO)和丙二醛(MDA)的含量，三種ATP酶的活性，蘭尼定受體-1mRNA(RyR1mRNA)的表達，凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達及細胞凋亡指數，并分析各指標之間的相關性。
　　 結果：第一部分(1)肉眼觀察結合光鏡觀察結果：A組與對照組相比，皮膚肉眼觀察并無差別，但光鏡下皮下結締組織和肌組織有輕度炎性反應；隨著壓強的增加，C組皮膚在經歷170mmHg壓力后，肉眼觀察局部出現持續(xù)非蒼白性發(fā)紅現象，同時其皮

7、下結締組織和肌組織炎性反應較重，與臨床典型的Ⅰ期壓瘡相似。(2)MPO含量檢測結果：各實驗組與對照組MPO含量分別兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）；各組分別與其他組進行MPO含量比較，除了B、C組之間差異無統計學意義(P＞0.05)，其余各組間差異均有統計學意義（P＜0.01）。第二部分(1)MPO和MDA含量檢測結果：實驗A、B兩組與對照組比較，二者含量顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.01）；隨著壓力循環(huán)增加，B組含

8、量較A組顯著增加，其差異具有統計學意義(P＜0.01)。(2)三種ATP酶活性檢測結果：隨著受壓循環(huán)的增加，三組總ATP酶活性、Ca2+Mg2+-ATP酶活性、Na+K+-ATP酶活性均呈下降趨勢，其組間差異具有統計學意義(P＜0.01)。(3)RyR1mRNA表達：隨著受壓循環(huán)的增加，實驗A組RyR1mRNA的表達較對照組下調，實驗B組與A組比較，表達下調，差異具有統計學意義(P＜0.05)。(4)凋亡指數（AI）：總的來說，實驗組A

9、I較對照組顯著增高，差異具有統計學意義(P＜0.01)；且隨著壓力循環(huán)的增加，B組較A組AI顯著增高，差異具有統計學意義(P＜0.01)。(5)Bax、Bcl-2蛋白表達：Bax蛋白在對照組幾乎不表達，隨著壓力循環(huán)增加，其表達顯著增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)。Bcl-2蛋白在對照組少量表達，隨著受壓循環(huán)增加，A組較對照組表達明顯增多，而B組其表達顯著減少，差異具有統計學意義(P＜0.01)。(6)Bcl-2/Bax比值變化結

10、果：對照組中Bcl-2/Bax比值遠大于A組和B組，其差異具有統計學意義(P＜0.01)；隨著壓力循環(huán)增加，比值呈下降趨勢，差異具有統計學意義（P＜0.01）。(7)相關分析結果：MPO與MDA含量呈顯著正相關關系(P＜0.01)，相關系數r為0.895;總ATP酶活力與MDA含量呈顯著負相關關系，相關系數r為-0.918(P＜0.01):總ATP酶活力與RyR1mRNA表達呈顯著正相關關系，相關系數r為0.713(P＜0.01);Ry

11、R1mRNA表達與MDA含量呈顯著負相關關系，相關系數r為-0.702(P＜0.01)。Bcl-2/Bax比值與AI及Bax分別呈顯著的負相關關系(P＜0.01)，相關系數r分別為-0.640、-0.621;MDA含量與細胞凋亡指數(AI)呈顯著正相關關系(P＜0.01)，相關系數r為0.916:MPO含量與AI呈顯著正相關關系(P＜0.01)，相關系數r為0.922。
　　 結論：(1)早期壓瘡動物模型建立成功；170mmHg