中國地方山羊PRNP、SPRN和37-67-kDa LRP-LR基因研究.pdf

1、羊癢病是一種傳染性海綿狀腦病(TSEs),是由正常的宿主細胞型朊蛋白構(gòu)象改變且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中積累引起的。本研究從中國地方山羊品種入手,對與TSEs發(fā)生與發(fā)展相關(guān)的三個基因PRNP、SPRN和37/67-kDa LRP/LR進行研究,為從遺傳學(xué)角度控制山羊癢病的發(fā)生提供理論基礎(chǔ),并為中國地方山羊的抗癢病育種提供依據(jù)。
　　 利用生物信息學(xué)對PRNP基因的系統(tǒng)進化進行研究,對屬于26個科56個屬的83個物種共計937條PRNP基因

2、編碼區(qū)序列進行分析,結(jié)果表明所有物種PRNP基因編碼區(qū)長度變異為567-825bp,主要是由于種內(nèi)或種間重復(fù)區(qū)的插入/缺失引起的。PRNP基因優(yōu)先利用終止密碼子TGA。在反芻動物中,牛具有最小的核苷酸差異(0.811)和多樣性(0.0011)和較小的非同義核苷酸多樣性。海豚科具有最小的總突變(3)、沉默突變(2)、非同義突變(1)、平均核苷酸差異數(shù)(2.000)、同義核苷酸多樣性(π(s),0.00739)和非同義核苷酸多樣性(π(a)

3、,0.00113)。鼠科具有最大的總突變(349)、沉默突變(94)、非同義突變(253)、平均核苷酸差異數(shù)(150)和核苷酸多樣性(0.19617)。鼠科和?？凭哂休^高的非同義核苷酸多樣性與同義核苷酸多樣性比值π(a)/π(s)(0.673和1.209)?；诓煌苹蛭锓NPRNP基因,構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹除了貓科以外,基本與NCBI上的分類學(xué)一致。
　　 對山羊PRNP基因編碼區(qū)突變位點在中國地方山羊中的分布進行研究,對8個省份1

4、1個中國地方山羊品種共計337份血液/腎臟樣品,提取山羊基因組DNA,PCR擴增山羊PRNP基因,通過序列測定,對PRNP基因多態(tài)性進行分析,以確定PRNP基因的多態(tài)性情況以及這些山羊品種對癢病的感染風(fēng)險。研究發(fā)現(xiàn)山羊PRNP基因編碼區(qū)存在10個氨基酸變異位點(102、127、143、146、154、211、218、219、222和240)和3個同義替代位點(42、125和138),其中R211G和T219I為首次發(fā)現(xiàn)。這些氨基酸變異位

5、點共組成28個等位基因和49個基因型,與山羊癢病抗性有關(guān)的142M在所研究的山羊群體中未檢測到,其他與抗性/潛伏期相關(guān)的位點146S、154H和127S分別只在1個個體中檢測到,對感染癢病具有保護作用的211Q在22個個體中檢測到,重要的癢病抗性候選位點222K在所研究的地方山羊中分布較低。等位基因在中國南北方地區(qū)地方山羊品種中的分布存在著差異。研究結(jié)果將為評估中國地方山羊患病風(fēng)險提供重要資料。
　　 對山羊PRNP基因非編碼區(qū)

6、的序列特征和變異位點進行分析,PCR擴增5’UTR、內(nèi)含子1和3’UTR,利用獲得的序列進行分析,山羊PRNP基因含有2個CpG島。推測啟動子核心區(qū)域為4648-5169bp,該區(qū)域包括15個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。預(yù)測4個保守基序motif1、motif2、motif3和motif4序列分別為轉(zhuǎn)錄因子YY1、E4BP4、Foxp3和COE1的結(jié)合位點。內(nèi)含子1具有啟動子活性。在山羊PRNP基因5’側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)52個SNPs,3’UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)3

7、5個SNPs。對引起轉(zhuǎn)錄因子C/EBP a1pha結(jié)合位點的丟失的2140位點進行多態(tài)性分析,結(jié)果表明等位基因A(GA非缺失)為優(yōu)勢等位基因,等位基因B(GA缺失)在不同群體中的基因頻率在0.1452-0.4000之間。遼寧絨山羊和太行山羊中B基因頻率較低,并且沒有發(fā)現(xiàn)BB基因型。利用熒光素酶報告基因載體研究2140位點變異對啟動子活性的影響,表明該位點變異改變了啟動子活性。
　　 利用Westem blot對PrPc在山羊組織

8、器官中的表達進行研究,PrPc在太行山羊小腦、腦干、丘腦、肝臟、脾臟、腎臟和肌肉中均表達,尤其在小腦、腦干、丘腦中表達量最高。在肺臟中未檢測到表達。雙糖基化PrP在所研究的組織中為主要表現(xiàn)形式。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對PrPc在山羊組織器官中的分布進行研究,在小腦分子層、顆粒層和浦肯野細胞、丘腦與腦干的神經(jīng)元細胞體、腎臟腎小球和近曲小管、肝臟細胞和脾臟髓系樹突狀細胞檢測到PrPc的表達。
　　 克隆獲得了山羊SPRN基因包括完整開

9、放閱讀框在內(nèi)的4237bp,開放閱讀框為441bp,編碼146個氨基酸。該基因不含TATA盒或CCAAT盒,存在轉(zhuǎn)錄因子Sp1、AP-2和YY1的結(jié)合位點。利用熒光素酶報告基因載體對啟動子活性進行研究,表明在323-1329bp存在調(diào)控基因表達的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合位點,而在111-323bp間存在著抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)控的調(diào)控因子結(jié)合位點。在山羊SPRN基因發(fā)現(xiàn)36個突變位點,其中啟動子區(qū)10個,內(nèi)含子1中3個,編碼區(qū)7個(5個引起氨基酸變異)

10、,15個位于3’UTR。組織表達譜結(jié)果表明該基因在山羊大腦和小腦中表達量較高,在睪丸、腸系膜淋巴結(jié)和肺臟中有表達但很低,其他組織中未檢測到表達。
　　 克隆獲得了山羊37/67-kDa LRP/LR基因的基因組序列和完整編碼區(qū)cCNA序列,獲得了全長為13587bp的基因組序列,由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成,開放閱讀框為888bp,編碼295個氨基酸。山羊37/67-kDa LRP/LR基因在241、272和291處與其他易感癢

11、病的氨基酸序列相同。山羊37/67-kDa LRP/LR基因5’側(cè)翼區(qū)存在潛在的轉(zhuǎn)錄因子Sp1、AP-1和AP-2結(jié)合位點,同時存在著TATA盒和CCAAT盒。在山羊37/67-kDaLRP/LR基因發(fā)現(xiàn)16個變異位點,其中外顯子1第17位的C→T突變影響Has-mir-1266,外顯子7中第84位A→G突變影響has-mir-518c-star。RT-PCR結(jié)果顯示37/67-kDaLRP/LR Mrna在山羊11個組織中均表達,在大