副干酪乳酸桿菌X12肽聚糖的提取及誘導結(jié)腸癌細胞免疫原性死亡的作用研究.pdf

1、肽聚糖是乳酸桿菌細胞壁的主要成分,對多種腫瘤具有拮抗作用。目前認為,肽聚糖抗腫瘤主要通過免疫調(diào)節(jié)功能實現(xiàn)。免疫原性死亡被認為是免疫調(diào)節(jié)類抗腫瘤藥物的關鍵機制。本研究從前期篩選的具有抗結(jié)腸癌的乳酸菌L.paracasei subp.paracasei X12細胞壁中提取肽聚糖并在此基礎上探討其對結(jié)腸癌細胞免疫原性死亡的作用及初步機制。
　　(1)采用TCA法提取L.paracasei subp.paracasei X12肽聚糖并對其

2、進行鑒定及其組分分析。肽聚糖提取率為6.79％;在透射電鏡下觀察,肽聚糖提取物呈囊狀且透明,保留菌體的形態(tài),具有特征性溶菌酶活性。組成分析表明,肽聚糖提取物中總糖含量為100.86μg/mg,蛋白質(zhì)為0.203μg/mg;氨基酸構(gòu)成分析表明,肽聚糖提取物中富含肽聚糖特有的氨基酸成分,即天冬氨酸(45.54μg/mL)、谷氨酸(54.63μg/mL)、丙氨酸(56.82μg/mL)、賴氨酸(31.27μg/mL)。紫外可見光掃描及SDS凝

3、膠電泳結(jié)果顯示,肽聚糖提取物與肽聚糖標準品的最大吸收峰均在260nm處,分子量范圍在主要14-50KD之間。
　　(2)肽聚糖能抑制HT-29細胞增殖。肽聚糖(1600μg/mL)作用細胞48h,其最大抑制率為24.76%。透射電鏡研究發(fā)現(xiàn),肽聚糖提取物能誘導HT-29細胞染色質(zhì)凝聚、凋亡小體出現(xiàn)等特征性細胞凋亡的病理改變,并呈劑量-效用關系。肽聚糖提取物還能以劑量依賴方式損傷HT-29細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體結(jié)構(gòu),出現(xiàn)腫脹、擴張等病

4、理改變。
　　(3)采用免疫細胞熒光技術(shù)和流式細胞術(shù),明確了肽聚糖對免疫原性死亡標志蛋白—鈣網(wǎng)蛋白的調(diào)控作用。肽聚糖濃度能以劑量依賴和時間依賴方式誘導鈣網(wǎng)蛋白向細胞膜的轉(zhuǎn)位,流式細胞術(shù)證實細胞膜表面的鈣網(wǎng)蛋白熒光強度顯著增加。肽聚糖提取物能促進鈣網(wǎng)蛋白上游因子,即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放到細胞胞漿中,使胞漿中鈣離子濃度顯著升高。隨后研究發(fā)現(xiàn),肽聚糖提取物能增加鈣網(wǎng)蛋白的下游免疫信號因子IL-8和TNF-α分泌。
　　綜上,本研究結(jié)果