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文檔簡介
1、沙拉沙星(SARA)是新型的動物專用藥,于1995年在美國上市,是美國第一個被批準(zhǔn)用于動物性食品的氟喹諾酮類藥物,該藥是廣譜抗菌藥。由于其具有良好的殺菌效果、且價格低廉而被廣泛使用。
雖然SARA被批準(zhǔn)用于對大腸桿菌等病菌的治療,但是若氟喹諾酮類藥在動物源食品中殘留而被人食用,可能會加速人類病原體對抗生素耐藥性。國內(nèi)規(guī)定SARA的最高殘留量為80μg/Kg。目前,氟喹諾酮類藥物的檢測的常規(guī)方法包括紫外分光光度測定、高效液相色譜
2、、時間分辨化學(xué)發(fā)光法等。以上檢測方法的精確度和靈敏度都很高,這些檢測方法需要的設(shè)備比較昂貴,且樣品前期處理較為繁瑣,只能限于實驗室內(nèi)檢測,不能滿足現(xiàn)場快速監(jiān)測食品中殘留的需要,故需建立一種能快速準(zhǔn)確檢測SARA殘留且成本較低的檢測方法。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是一種具有簡便易操作、檢測快,靈敏度和準(zhǔn)確度高,能實現(xiàn)現(xiàn)場檢測等特點的檢測方法,且成本較低,能夠彌補大型儀器所帶來的不足。近年來隨著 ELISA的不斷發(fā)展,ELISA在農(nóng)藥和獸
3、藥快速檢測方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。
建立SARA的ELISA檢測方法需要制備SARA的單克隆抗體,由于SARA是小分子物質(zhì),屬于半抗原,自身有反應(yīng)原性卻無免疫原性,所以SARA需要與大分子物質(zhì)相結(jié)合,通過人工的方法合成免疫原,SARA才能獲得免疫原性,然后通過免疫小鼠獲得小鼠多抗血清,進而制備SARA單克隆抗體和建立ELISA檢測方法。本研究根據(jù)ELISA在檢測方面的特點和優(yōu)點,通過人工合成免疫原SARA-BSA,免疫小鼠而獲得
4、高親和特異性多抗血清,為制備SARA單克隆抗體和建立SARA ELISA檢測方法奠定基礎(chǔ)。
1.人工抗原的合成與鑒定
采用碳二亞胺法(EDC法),分別將沙拉沙星(SARA)與牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶聯(lián),制備了免疫原SARA-BSA和包被原SARA-OVA。通過使用紫外掃描法(UV)、SDS-PAGE凝膠電泳對免疫原SARA-BSA和包被原SARA-OVA進行了初步鑒定。根據(jù)鑒定結(jié)果,初步證明SAR
5、A人工抗原制備成功。
2.單克隆抗體的制備與鑒定
選擇多克隆抗體效價高、特異性好的小鼠進行融合,利用單克隆抗體技術(shù),結(jié)合ELISA篩選體系,最終成功篩選出可以穩(wěn)定產(chǎn)生親和力好、特異性強的抗SARA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2株,其編號分別為1G3、3H3,用體內(nèi)誘生腹水法制備腹水,經(jīng)純化后鑒定,抗體的效價為1:5.12×105,IC50=6.34ng/mL,親和常數(shù)分別為8.55×108L/mol, SARA抗體與諾氟
6、沙星的交叉反應(yīng)率為1.06%,與同類藥物及其他類藥物的競爭交叉反應(yīng)率均小于0.5%。
3.SARA間接競爭ELISA快速檢測試劑盒的組裝
利用制備的SARA單克隆抗體和間接競爭ELISA檢測原理,組裝了SARA間接競爭 ELISA試劑盒。試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈典型 S型,相關(guān)線性回歸方程為y=-0.3848x+0.7363,R2為0.9901,根據(jù)回歸方程計算出IC50=4.11 ng/mL。試劑盒的特異性很好,與其他藥
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