PEG修飾ω-干擾素與尿酸氧化酶的制備、純化、結(jié)構(gòu)分析與生物活性的研究.pdf

1、聚乙二醇(PEG)已被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、化妝品、化纖等領(lǐng)域。PEG由于其良好的水溶性,與許多有機(jī)物組分有良好的相容性。
　　 重組人ω-干擾素(rhIFN-ω)由于具有免疫調(diào)節(jié),抗病毒作用,可用來治療乙型肝炎、丙型肝炎以及癌癥。目前在食品科學(xué)、醫(yī)藥臨床應(yīng)用最多的是α-干擾素(IFN-α),如IFN-α-2a,IFN-α-2b。有研究發(fā)現(xiàn)在治療某些疾病方面IFN-ω比IFN-α作用效果更好。隨著對ω-干擾素研究的深入,h

2、IFN-ω基因已在E.coli、乳酸乳球菌、CHO細(xì)胞、離體昆蟲細(xì)胞Sf9的桿狀病毒、畢赤酵母等表達(dá)系統(tǒng)中得到了成功表達(dá)。
　　 本論文通過2-亞氨基硫烷鹽酸鹽(Traunt's Reagent,IT)修飾ω-干擾素后引入巰基,再通過馬來酰亞胺基聚乙二醇(M-MAL)修飾引入的巰基。分析比較聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)IT連接修飾IFN-ω、聚乙二醇醛(M-ALD)直接修飾與IFN原蛋白的理化性質(zhì),

3、藥效及藥代活性。采用Superdex200凝膠柱過濾分析修飾產(chǎn)物,得出最佳的修飾條件。通過AKTA蛋白純化系統(tǒng)與Superdex200凝膠過濾柱收集單修飾IFN-ω。采用凝膠過濾分析及SDS-PAGE(對鈉十二烷基的硫酸鹽聚丙烯酰胺凝膠電泳法)檢測修飾產(chǎn)物的純度。
　　 結(jié)果表明,IFN-ω、IT、M-MAL-20K的最佳修飾比例為1:4:4；IFN-ω、IT與M-MAL-40K的最佳修飾比例為1:2:2；IFN-ω、NaCNB

4、H3與M-ALD-20K的最佳修飾比例為1:100:10；IFN-ω)、NaCNBH3,與M-ALD-40K的最佳修飾比例為1:60:6。
　　 運用AKTA純化收集及Superdex200 prep grade(16×60 i.d.)凝膠柱分離純化PEG單修飾IFN-ω。SDS-PAGE電泳及高效液相色譜凝膠分析檢測結(jié)果表明:PEG單修飾ω-干擾素的純度均超過95％。運用胰蛋白酶酶切圖譜確定PEG修飾位點。用圓二色光譜(CD)

5、與熒光光譜(FL)測定IFN-ω與其PEG修飾產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明:M-MAL與M-ALD修飾位點均可能在Lys-43或Lys-46；PEG修飾后IFN-ω的結(jié)構(gòu)與原蛋白非常接近；藥效分析證明經(jīng)Traunt's Reagent引入巰基后,再使用M-MAL修飾比直接使用M-ALD修飾的效果好；經(jīng)PEG修飾后,藥代時間延長,其中PEG-40K的藥代時間比PEG-20K更長。
　　 尿酸氧化酶(UOX)用來治療痛風(fēng)及高尿

6、酸血癥。由于UOX含有3個自由巰基,直接修飾會影響其活性,用2,2’-二硫二吡啶(Aldrithiol)與UOX的自由巰基暫時結(jié)合。除去未結(jié)合的Aldrithiol后,用IT與UOX連接引入自由巰基,再用M-MAL修飾此巰基位點。最后用磷酸三氯乙酯(TCEP)除去結(jié)合的Aldrithiol。
　　 用與IFN-ω同樣的分離方法,分離純化PEG修飾UOX。SDS-PAGE電泳檢測收集的PEG修飾產(chǎn)物。結(jié)果表明經(jīng)PEG修飾后,其多修