融合表達人β干擾素-1b(17Ser-IFN-β)的制備及PEG修飾.pdf

1、目的:采用融合表達方式獲得無需復(fù)性的點突變重組人β干擾素-1b(17Ser-IFN-β-1b),并通過PEG修飾制備PEG-β-IFN-1b。
　　方法:通過PCR技術(shù)獲得含有不同蛋白酶酶切識別位點的基因序列,分別構(gòu)建重組表達載體pET-32a-EK-β-IFN-1b、pET-32a-TEV-β-IFN-1b、pET-32a-thrombin-β-IFN-1b。然后轉(zhuǎn)化表達菌Origami DE3表達融合蛋白,經(jīng)純化回收的融合蛋白

2、分別用相應(yīng)的蛋白酶酶切,根據(jù)融合蛋白的酶切效率和酶切特異性,篩選制備重組人β干擾素-1b的工程質(zhì)粒和工程菌。酶切后的融合蛋白經(jīng)反相C18精純化,獲得高純度的重組人β干擾素-1b,并進行PEG修飾,制備單一的修飾產(chǎn)物,通過Wish/VSV法測定其抗病毒比活性。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了含單一蛋白酶切位點的重組載體 pET-32a-EK-β-IFN-1b、pET-32a-TEV-β-IFN-1b、pET-32a-thrombin–β-IF

3、N-1b,經(jīng)DNA測序正確。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌Origami DE3構(gòu)建的工程菌,經(jīng)誘導(dǎo)表達的融合蛋白占菌體總蛋白的20％以上。破菌后純化回收的融合蛋白通過相應(yīng)的蛋白酶酶切篩選,最終選擇pET-32a-EK-β-IFN-1b作為重組工程質(zhì)粒,pET-32a-EK-β-IFN-1b/Origami DE3作為重組工程菌。Ni柱親和純化回收的融合蛋白,EK酶酶切效率不低于90%。制備的重組人β干擾素-1b純度高達98%以上,質(zhì)譜分子量與理論